Седьмая Директива Комиссии 96/45/EC от 2 июля 1996 г., касающаяся методов анализа, необходимых для проверки состава косметических продуктов (текст имеет отношение к ЕЭЗ)

СЕДЬМАЯ ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 96/45/EC от 2 июля 1996 г., касающаяся методов анализа, необходимых для проверки состава косметических продуктов (текст имеет отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 76/768/EEC от 27 июля 1976 г. о сближении законов государств-членов, касающихся косметической продукции (1), с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 95/34/EC (2), и, в частности, Статья 8 (1) этого закона,

Принимая во внимание, что Директива 76/768/EEC предусматривает официальное тестирование косметической продукции с целью обеспечения соблюдения условий, установленных положениями Сообщества относительно состава косметической продукции;

Принимая во внимание, что все необходимые методы анализа должны быть разработаны как можно быстрее; тогда как определенные методы уже приняты в Директивах Комиссии 80/1335/EEC (3) с поправками, внесенными Директивой 87/143/EEC (4), 82/434/EEC (5) с поправками, внесенными Директивой 90/207/EEC (6) и Директивами Комиссии 83/514/EEC (7), 85/490/EEC (8), 93/73/EEC (9) и 95/32/EC (10);

Принимая во внимание, что идентификация и определение 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-2-ола, метила, этила, пропила, бутила и бензил-4-гидроксибензоата в косметических продуктах составляют седьмой этап;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Комитета по адаптации Директивы 76/768/ЕЕС к техническому прогрессу,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩЕЕ РЕШЕНИЕ:

Статья 1

Государства-члены должны принять все необходимые меры для обеспечения того, чтобы во время официального тестирования косметической продукции проводилась идентификация и определение 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-2-ола, метила, этил, пропила, бутила и бензил-4-гидроксибензоата. Выводят в соответствии с методом, описанным в приложении.

Статья 2

1. Государства-члены должны ввести в действие законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 30 сентября 1997 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

2. Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки утверждается государствами-членами.

3. Государства-члены должны сообщить Комиссии положения национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 2 июля 1996 года.

Для Комиссии

Эмма БОНИНО

Член Комиссии

(1) ОЖ № L 262, 27.9.1976, с. 169.

(2) ОЖ № L 167, 18.07.1995, с. 19.

(3) ОЖ № L 383, 31.12.1980, с. 27.

(4) ОЖ № L 57, 27.2.1987, с. 56.

(5) ОЖ № L 185, 30.6.1982, с. 1.

(6) ОЖ № L 108, 28.4.1990, с. 92.

(7) ОЖ № L 291, 24.10.1983, с. 9.

(8) ОЖ № L 295, 7.11.1985, с. 30.

(9) ОЖ № L 231, 14.9.1993, с. 3. 4.

(10) ОЖ № L 178, 28.7.1995, с. двадцать.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-ФЕНОКСИЭТАНОЛА, 1-ФЕНОКСИПРОПАН-2-ОЛА, МЕТИЛА, ЭТИЛА, ПРОПИЛА, БУТИЛА И БЕНЗИЛ-4-ГИДРОКСИБЕНЗОАТА В КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Область применения и применение.

Этот метод предусматривает процедуру ТСХ, которая в сочетании с методом определения, описанным в разделе B, позволяет идентифицировать 2-феноксиэтанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил-4-гидроксибензоат, этил-4-гидроксибензоат, пропил-4-гидроксибензоат, бутил-4-гидроксибензоат и бензил-4-гидроксибензоат в косметических продуктах.

2. Принцип

Консерванты экстрагируются из подкисленного косметического образца ацетоном. После фильтрации раствор ацетона смешивают с водой и в щелочной среде жирные кислоты осаждаются в виде их кальциевых солей. Щелочную смесь ацетона и воды экстрагируют диэтиловым эфиром для удаления липофильных веществ. После подкисления консерванты экстрагируют диэтиловым эфиром. Аликвоту экстракта диэтилового эфира наносят на тонкослойную пластинку, покрытую силикагелем. После проявления пластинки полученную хроматограмму наблюдают в УФ-свете и визуализируют с помощью реактива Миллона.

3. Реагенты

3.1. Общий

Все используемые реагенты должны быть аналитической чистоты. Вода должна быть дистиллированной или водой, по крайней мере, такой же чистоты.

3.2. Ацетон

3.3. Диэтиловый эфир

3.4. н-пентан

3.5. Метанол

3.6. Уксусная кислота ледяная

3.7. Раствор соляной кислоты, c(HCl)=4моль/л

3.8. Раствор гидроксида калия, c(KOH)=4 моль/л

3.9. Дигидрат хлорида кальция (CaCl2 · 72H2O)

3.10. Реактив для обнаружения: реактив Миллона.

Реактив Миллона (нитрат ртути (II)) представляет собой готовый раствор, который имеется в продаже (Fluka 69820).

3.11. 2-феноксиэтанол

3.12. 1-феноксипропан-2-ол

3.13. Метил 4-гидроксибензоат (метилпарабен)

3.14. Этил-4-гидроксибензоат (этилпарабен)

3.15. н-пропил 4-гидроксибензоат (пропилпарабен)

3.16. н-Бутил-4-гидроксибензоат (бутилпарабен)

3.17. Бензил-4-гидроксибензоат (бензилпарабен)

3.18. Эталонные решения

Приготовьте 0,1 % (м/об) растворы каждого из стандартных веществ 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 и 3.17 в метаноле.

3.19. Проявочный растворитель

Смешать 88 объемов н-пентана (3,4) с 12 объемами ледяной уксусной кислоты (3,6).

4. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование и:

4.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60 °C.

4.2. Проявочный резервуар (без фильтровальной бумаги)

4.3. Источник ультрафиолетового света, 254 нм

4.4. Тонкослойные пластины размером 20 см × 20 см, предварительно покрытые силикагелем 60F254 толщиной 0,25 мм, с зоной концентрирования (Merck № 11798, Дармштадт или аналогичный)

4.5. Духовка, способная поддерживать температуру до 105 °C.

4.6. Фен с горячим воздухом

4.7. Шерстяной малярный валик, длина около 10 см, внешний диаметр около 3,5 см. Толщина слоя шерсти должна составлять от 2 до 3 мм. При необходимости подстригите шерсть.

См. примечание к 5.2.

4.8. Стеклянные пробирки объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой.

4.9. Электрическая нагревательная плита с термостатическим регулятором температуры. Настройка температуры: около 80 °C. Нагревательную плиту необходимо накрыть алюминиевой пластиной размером 20 × 20 см и толщиной около 6 мм, чтобы обеспечить равномерное распределение тепла.

5. Процедура

5.1. Базовые приготовления

Взвешивают примерно 1 г образца в стеклянной пробирке вместимостью 50 мл с завинчивающейся крышкой (4.8). Добавьте четыре капли раствора соляной кислоты (3,7) и 40 мл ацетона.

К сильноосновным косметическим продуктам, таким как туалетное мыло, добавляют 20 капель раствора соляной кислоты. Закройте пробирку, осторожно нагрейте смесь примерно до 60 °C, чтобы облегчить экстракцию консервантов в ацетоновую фазу, и энергично встряхивайте в течение одной минуты.

Измерьте pH раствора с помощью индикаторной бумаги pH и отрегулируйте pH раствора ≤ 3 раствором соляной кислоты. Снова энергично встряхните в течение одной минуты.

Остудить раствор до комнатной температуры и профильтровать через бумажный фильтр в коническую колбу. 20 мл фильтрата переносят в коническую колбу вместимостью 200 мл, добавляют 60 мл воды и перемешивают. Доведите pH смеси примерно до 10 с помощью гидроксида калия (3,8), используя индикаторную бумагу pH.

Добавьте 1 г дигидрата хлорида кальция (3.9) и энергично встряхните. Отфильтруйте раствор через фильтровальную бумагу в делительную воронку емкостью 250 мл, содержащую 75 мл диэтилового эфира, и энергично встряхивайте в течение одной минуты. Дайте фазам разделиться и соберите водный слой в коническую колбу емкостью 200 мл. Доведите pH раствора примерно до 2 с помощью раствора соляной кислоты, используя индикаторную бумагу pH. Затем добавьте 10 мл диэтилового эфира и энергично встряхивайте в течение одной минуты. Дайте фазам разделиться и перенесите примерно 2 мл слоя диэтилового эфира в 5-мл флакон для образца.

5.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Поместите пластинку ТСХ (4.4) на нагретую алюминиевую пластину (4.9). Нанесите по 10 мкл каждого эталонного раствора (3.18) и 100 мкл раствора(ов) образца (5.1) на стартовую линию в зоне концентрации пластинки ТСХ.

При желании можно использовать поток воздуха для облегчения испарения растворителя. Снимите пластину ТСХ с нагревательной пластины и дайте остыть до комнатной температуры. Перенесите 100 мл растворителя проявителя (3.19) в резервуар для проявления (4.2).

Немедленно поместите пластинку для ТСХ в ненасыщенную камеру и проявляйте при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не пройдет примерно 15 см от базовой линии. Выньте пластину из емкости для проявки и высушите в струе горячего воздуха с помощью фена с горячим воздухом.

Осмотрите пластинку в УФ-свете (4.3) и отметьте положение пятен. Нагревают пластинку в течение 30 минут в печи (4.5) при температуре 100 °С, чтобы удалить избыток уксусной кислоты. Визуализируйте консерванты на хроматограмме с реактивом Миллона (3.10), погружая малярный валик (4.7) в реагент и прокатывая по пластине ТСХ до равномерного смачивания.

Примечание. В качестве альтернативы пятна можно визуализировать, осторожно нанеся каплю реагента Миллона на каждое из отмеченных пятен в УФ-свете.

Эфиры 4-гидроксибензойной кислоты проявляются в виде красных пятен, 2-феноксиэтанола и 1-феноксипропан-2-ола – в виде желтых пятен. Однако обратите внимание, что сама 4-гидроксибензойная кислота, которая может присутствовать в образцах в качестве консерванта или продукта разложения парабенов, также будет проявляться в виде красного пятна. См. 7.3 и 7.4.

6. Идентификация

Рассчитайте значение Rf для каждого пятна. Сравните пятна, полученные от раствора образца, с пятнами эталонных растворов относительно их значений Rf, их поведения под УФ-излучением и цвета после визуализации. Сделайте предварительные выводы о личности консервантов.

Если обнаружено присутствие парабенов, следует выполнить процедуру ВЭЖХ, описанную в разделе B. Объедините результаты ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), чтобы подтвердить наличие 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-2-ола и парабенов.

7. Замечания

7.1. Из-за токсичности реактива Миллона этот реагент лучше всего применять с помощью одной из описанных методик. Опрыскивание не рекомендуется.

7.2. Другие соединения, содержащие гидроксильные группы, также могут давать цвет с помощью реактива Миллона. Таблицу цветов и значений Rf, полученных для ряда консервантов с использованием этой процедуры ТСХ, можно найти в: N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1987): Определение консервантов в косметических продуктах I. : Процедура тонкослойной хроматографии для идентификации консервантов в косметических продуктах (J. Chomatography 410, 395-411).

7.3. Значения Rf, перечисленные в следующей таблице, служат указанием значений, которые можно получить:

>ТАБЛИЦА>

7.4. Разделения 4-гидроксибензойной кислоты и метилпарабена или бензилпарабена и этилпарабена не получено. Идентификация этих соединений должна быть подтверждена путем применения метода ВЭЖХ, описанного в разделе B, и сравнения времени удерживания, полученного для образца, со временем удерживания стандартов.

Б. РЕШЕНИЕ

1. Область применения и применение.

Настоящий метод определяет процедуру определения 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-2-ола, метил-4-гидроксибензоата, этил-4-гидроксибензоата, пропил-4-гидроксибензоата, бутил-4-гидроксибнензоата и бензил-4-гидроксибензоата в косметических продуктах.

2. Определение

Количества консервантов, определенные этим методом, выражают в процентах по массе.

3. Принцип

Пробу подкисляют добавлением серной кислоты, а затем суспендируют в смеси этанола и воды. После осторожного нагревания смеси до расплавления липидной фазы и ускорения количественной экстракции смесь фильтруют.

Содержание консервантов в фильтрате определяют обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием изопропил-4-гидроксибензоата в качестве внутреннего стандарта.

4. Реагенты

4.1. Общий

Все реагенты должны иметь аналитическую чистоту и при необходимости подходить для ВЭЖХ. Вода должна быть дистиллированной или водой, по крайней мере, такой же чистоты.

4.2. Этанол, абсолютный

4.3. 2-феноксиэтанол

4.4. 1-феноксипропан-2-ол

4.5. Метил 4-гидроксибензоат (метилпарабен)

4.6. Этил-4-гидроксибензоат (этилпарабен)

4.7. н-пропил 4-гидроксибензоат (пропилпарабен)

4.8. Изопропил-4-гидроксибензоат (изопропилпарабен)

4.9. н-Бутил-4-гидроксибензоат (бутилпарабен)

4.10. Бензил-4-гидроксибензоат (бензилпарабен)

4.11. Тетрагидрофуран

4.12. Метанол

4.13. Ацетонитрил

4.14. Раствор серной кислоты c(H2SO4)=2моль/л

4.15. Смесь этанола и воды

Смешайте девять объемов этанола (4.2) и один объем воды.

4.16. Внутреннее стандартное решение

Точно отвешивают примерно 0,25 г изопропилпарабена (4.8), переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют и доводят до объема смесью этанола и воды (4.15).

4.17. Подвижная фаза: смесь тетрагидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил.

Смешайте 5 объемов тетрагидрофурана, 60 объемов воды, 10 объемов метанола и 25 объемов ацетонитрила.

4.18. Консервирующий исходный раствор

Точно взвесьте примерно 0,2 г 2-феноксиэтанола, 0,2 г 1-феноксипропан-2-ола, 0,05 г метилпарабена, 0,05 г этилпарабена, 0,05 г пропилпарабена, 0,05 г бутилпарабена и 0,025 г бензилпарабена. в мерной колбе вместимостью 100 мл растворить и довести до объема смесью этанола и воды.

При хранении в холодильнике раствор стабилен в течение одной недели.

4.19. Стандартные консервирующие растворы

Из исходного раствора (4.18) переносят соответственно 20,00, 10,00, 5,00, 2,00 и 1,00 мл в мерные колбы вместимостью 50 мл. В каждую колбу добавляют по 10,00 мл раствора внутреннего стандарта (4.16) и 1,0 мл раствора серной кислоты (4.14) и доводят объем смесью этанола с водой. Эти растворы должны быть свежеприготовленными.

5. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование и:

5.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60°C ± 1°C.

5.2. Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, длина волны 280 нм.

5.3. Аналитическая колонка:

Нержавеющая сталь, внутренний диаметр 25 см × 4,6 мм. (или 12,5 см × 4,6 мм внутр. диаметр), упакованный Nucleosil 5C18 или его эквивалентом (см. 10.1)

5.4. Стеклянные пробирки емкостью 100 мл с завинчивающейся крышкой.

5.5. Щепка карборундовая размером от 2 до 4 мм или эквивалент.

6. Процедура

6.1. Базовые приготовления

6.1.1. Подготовка проб без добавления внутреннего стандарта

Взвесьте примерно 1,0 г образца в стеклянной пробирке объемом 100 мл с завинчивающейся крышкой. Внесите в пробирки по 1,0 мл раствора серной кислоты (4.14) и 50,0 мл смеси этанола с водой (4.15). Добавляют примерно 1 г кипящей стружки (5.5), закрывают пробирку и энергично встряхивают до получения однородной суспензии. Встряхивайте не менее одной минуты. Помещают пробирку на пять минут в водяную баню (5.1), поддерживаемую при температуре 60 ± 1 °С, чтобы облегчить экстракцию консервантов в этаноловую фазу.

Немедленно охладите пробирку в струе холодной воды и храните экстракт в холодильнике в течение одного часа. Отфильтруйте экстракт, используя фильтровальную бумагу. Перенесите примерно 2 мл фильтрата в 5-мл флакон для образца. Храните экстракты в холодильнике и проводите определение ВЭЖХ в течение 24 часов.

6.1.2. Подготовка проб, включая добавление внутреннего стандарта

Взвешивают с точностью до трех десятичных знаков 1,0 г ± 0,1 г образца в стеклянной пробирке вместимостью 100 мл с завинчивающейся крышкой.

Внесите пипеткой в ​​пробирку 1,0 мл раствора серной кислоты и 40,0 мл смеси этанола и воды. Добавьте примерно 1 г кипящей стружки (5,5) и ровно 10,00 мл раствора внутреннего стандарта. Закройте пробирку и энергично встряхните до получения однородной суспензии. Встряхивайте не менее одной минуты. Поместите пробирку на пять минут на водяную баню с температурой 60°C ± 1°C, чтобы облегчить экстракцию консервантов в этаноловую фазу.

Немедленно охладите пробирку в струе холодной водопроводной воды и храните экстракт в холодильнике в течение одного часа. Отфильтруйте экстракт, используя фильтровальную бумагу.

Перенесите примерно 2 мл фильтрата в 5-мл флакон для образца (тестовый раствор). Храните экстракт в холодильнике и проводите определения ВЭЖХ в течение 24 часов.

6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

6.2.1. Хроматографические условия

- Подвижная фаза: смесь тетрагидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил (4.17).

- Скорость потока: 1,5 мл/мин.

- Длина волны обнаружения: 280 нм

6.2.2. Калибровка

Вводят по 10 мкл каждого стандартного консервирующего раствора (4.19). По полученным хроматограммам определяют отношения высоты пиков стандартных растворов консерванта к высоте пика внутреннего стандарта. Постройте кривую для каждого консерванта, связывающую эти соотношения с концентрациями стандартных растворов.

6.2.3. Определение

Вводят 10 мкл раствора пробы без внутреннего стандарта (6.1.1) в хроматограф и записывают хроматограмму.

Вводят 10 мкл одного из стандартных растворов консерванта (4.19) и записывают хроматограмму. Сравните полученные хроматограммы.

Если на хроматограмме экстракта пробы (6.1.1) не присутствует пик, имеющий примерно такое же время удерживания, как у изопропилпарабена (рекомендуемый внутренний стандарт), продолжайте, вводя 10 мкл раствора пробы с внутренним стандартом (6.1.2). Запишите хроматограмму и измерьте высоту пиков.

Если на хроматограмме раствора пробы, имеющего примерно такое же время удерживания, как и у изопропилпарабена, наблюдается мешающий пик, следует выбрать другой внутренний стандарт.

Если один из исследуемых консервантов отсутствует в хроматограмме пробы, этот консервант можно использовать в качестве альтернативного внутреннего стандарта.

Рассчитайте отношения высоты пика исследуемых консервантов к высоте пика внутреннего стандарта.

Убедитесь, что для стандартных растворов, используемых в процедуре калибровки, получен линейный отклик.

Убедиться, что хроматограммы, полученные для стандартного раствора и раствора пробы, соответствуют следующим требованиям:

- пиковое разделение пары с худшим разделением должно быть не менее 0,90. (Определение разделения пиков см. на рисунке 1).

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

разделение пиков (p)

р=ж/г

Рисунок 1: Разделение пиков

Если требуемое разделение не достигается, следует использовать более эффективную колонку или корректировать состав подвижной фазы до тех пор, пока требование не будет выполнено.

- коэффициент асимметрии As всех полученных пиков должен находиться в пределах от 0,9 до 1,5. (Определение пикового коэффициента асимметрии см. на рисунке 2.) Для записи хроматограммы для определения коэффициента асимметрии рекомендуется использовать скорость диаграммы не менее 2 см/мин.

>ССЫЛКА НА ФИЛЬМ>

Коэффициент асимметрии (As)

Ас=б/а

Рисунок 2: Пиковый коэффициент асимметрии

- Должна быть получена устойчивая базовая линия.

7. Расчет

По калибровочной кривой (6.2.2) и отношениям высоты пика исследуемых консервантов к высоте пика внутреннего стандарта рассчитывают концентрацию консервантов в растворе пробы. Рассчитайте содержание 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-2-ола, метил-4-гидроксибензоата, этил-4-гидроксибензоата, пропил-4-гидроксибензоата, бутил-4-гидроксибензоата и бензил-4-гидроксибензоата, wi, в процентах по массе (% m/ м), используя формулу:

%wi (m/m) = >NUM>be >THEN>200 × a

в котором:

bi = концентрация (мкг/мл) консерванта i в тестируемом растворе, определенная по калибровочной кривой; и

a = масса (г) испытательного положения.

8. Повторяемость (1)

См. примечания 10.5.

9. Воспроизводимость (2)

См. примечания 10.5.

10. Замечания

10.1. Стационарная фаза

Поведение удерживания растворенных веществ при определениях ВЭЖХ сильно зависит от типа, марки и истории стационарной фазы. Можно ли использовать колонку для разделения исследуемых консервантов, можно сделать вывод по результатам, полученным для стандартных растворов (см. примечания 6.2.3). В дополнение к предложенному материалу для насадки колонок также оказались подходящими Hypersil ODS и Zorbax ODS.

Альтернативно, рекомендуемый состав подвижной фазы может быть оптимизирован для достижения требуемого разделения.

10.2. Длина волны обнаружения

Испытание на надежность описанного метода показало, что небольшое изменение длины волны обнаружения может оказать существенное влияние на результаты определения.

Поэтому этот параметр необходимо тщательно контролировать во время анализа.

10.3. Помехи

В условиях, описанных в этом методе, элюируются также многие другие соединения, такие как консерванты и косметические добавки. Время хранения большого количества консервантов, упомянутых в Приложении VI к Директиве Совета относительно косметической продукции, указано в: N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1989). Определение консервантов в косметической продукции II. Высокоэффективная жидкостная хроматографическая идентификация (J. Chromatography 469, 317-398).

10.4. Для выступания аналитической колонки можно использовать соответствующую защитную колонку.

10.5. Этот метод был исследован в ходе совместного испытания, в котором приняли участие девять лабораторий. Были проанализированы три образца. В следующей таблице для каждого из трех образцов приведены средние значения в % m/m (m), повторяемости (r), воспроизводимости (R), найденные для содержащихся в них аналитов:

>ТАБЛИЦА>

(1) ИСО 5725.