Директива Комиссии 2000/33/EC от 25 апреля 2000 г. об адаптации к техническому прогрессу в 27-й раз. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (Текст с Актуальность ЕЭЗ.)

Директива Комиссии 2000/33/EC

от 25 апреля 2000 г.

адаптация к техническому прогрессу в 27-й раз Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ(1)

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 67/548/EEC от 27 июня 1967 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ(2), с последними поправками, внесенными Директивой Европейского Парламента и Совета 1999 г./ 33/EC(3) и, в частности, его статья 28,

Тогда как:

(1) Приложение V к Директиве 67/548/EEC устанавливает методы определения физико-химических свойств, токсичности и экотоксичности веществ и препаратов. Необходимо адаптировать это Приложение к техническому прогрессу.

(2) В соответствии со статьей 7(2) Директивы Совета 86/609/EEC от 24 ноября 1986 г. о сближении законов, правил и административных положений государств-членов относительно защиты животных, используемых в экспериментальных и других научных целях(4) ), эксперимент, предполагающий использование животных, не должен проводиться, если разумно и практически доступен другой научно удовлетворительный метод получения искомого результата.

(3) Комиссия намерена ввести в Приложение V к Директиве 67/548/EEC некоторые альтернативные методы тестирования, не предполагающие использования животных, чтобы сделать их доступными для тестирования химических веществ в соответствии со Статьей 3(1) Директивы 67. /548/ЕЕС.

(4) Меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Комитета по адаптации к техническому прогрессу Директив по устранению технических барьеров в торговле опасными веществами и препаратами,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Тексты Приложений I и II к настоящей Директиве добавлены в Часть B Приложения V к Директиве 67/548/EEC.

Статья 2

1. Государства-члены должны ввести в действие законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 1 октября 2001 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в ​​случае их официальной публикации. Государства-члены ЕС должны определить, как следует делать такую ​​ссылку.

2. Государства-члены должны сообщить Комиссии основные положения национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой, а также таблицу корреляции между настоящей Директивой и принятыми национальными положениями.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на третий день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 25 апреля 2000 г.

Для Комиссии

Марго Вальстрём

Член Комиссии

(1) Принято до 26-й адаптации.

(2) ОЖ 196, 16 августа 1967 г., с. 1.

(3) OJ L 199, 30 июля 1999 г., с. 57.

(4) OJ L 358, 18.12.1986, с. 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

«Б.40. КОРРОЗИЯ КОЖИ

1. МЕТОД

1.1. Введение

Два теста in vitro на коррозионную активность кожи, анализ чрескожного электрического сопротивления кожи крысы (TER) и тест с использованием модели человеческой кожи были признаны научно обоснованными Европейским центром по валидации альтернативных методов (ECVAM, Объединенный исследовательский центр, Европейская Комиссия) (1) (2) (3). Валидационное исследование ECVAM продемонстрировало, что оба теста способны надежно различать известные разъедающие кожу и неагрессивные вещества. Кроме того, протокол испытаний, основанный на модели кожи человека, позволил правильно различать степени разъедающего воздействия (известные сильные разъедающие кожу вещества, R35, и другие разъедающие кожу вещества, R34) (2). Приведены описание и процедуры обоих испытаний; Выбор того, какой тест использовать, зависит от конкретных требований и предпочтений пользователя.

См. также Общее введение, Часть B.

1.2. Определения

Разъедание кожи: возникновение необратимого повреждения тканей кожи после нанесения исследуемого материала.

1.3. Эталонные вещества

Не указано, но см. пункты 1.5.3.4 и 1.7.2.3.

1.4. Принцип метода тестирования - TER-анализ кожи крысы

Исследуемый материал наносят на срок до 24 часов на эпидермальную поверхность кожных дисков, взятых из шкурок гуманно убитых молодых крыс. Коррозионные материалы идентифицируются по их способности вызывать потерю нормальной целостности рогового слоя и барьерной функции, что измеряется как снижение собственного TER ниже порогового уровня (5 кОм) (4) (5). Раздражающие и нераздражающие материалы не снижают ТЭР ниже порогового уровня. Стадия связывания красителя может быть включена в процедуру тестирования поверхностно-активных веществ и нейтральных органических веществ (определение см. в ссылке (6)), чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов, полученных именно с этими химическими типами (2) (7).

1,5. Описание метода тестирования - TER-анализ кожи крысы

1.5.1. Животные

Для приготовления кожных дисков требуются молодые (20-23 дня) крысы (Wistar или аналогичная линия). Волосы на спине и боках аккуратно удаляются машинками для стрижки мелких животных. Затем животных промывают, тщательно вытирая, погружая пораженный участок в раствор антибиотика (содержащий, например, стрептомицин, пенициллин, хлорамфеникол и амфотерицин в концентрациях, эффективных для подавления роста бактерий). Животных повторно промывают антибиотиками на третий-четвёртый день после первой промывки и используют в течение 3 дней (для приготовления шкурок животные не должны быть старше 31 дня).

1.5.2. Подготовка дисков кожи

Животные убивают гуманно. Затем шкуру со спины каждого животного удаляют и очищают от лишнего жира, осторожно отделяя ее от кожи. Шкурку помещают на конец трубки из политетрафторэтилена (ПТФЭ), обеспечивая контакт поверхности эпидермиса с трубкой. Резиновое уплотнительное кольцо надевается на конец трубки, чтобы удерживать кожу на месте, а лишняя ткань обрезается. Размеры трубки и уплотнительного кольца показаны на рисунке 1. Затем резиновое уплотнительное кольцо тщательно герметизируют с концом трубки из ПТФЭ вазелином. Трубка поддерживается пружинным зажимом внутри рецепторной камеры, содержащей раствор сульфата магния (154 мМ) (рис. 2).

1.5.3. Тестовая процедура

1.5.3.1. Применение испытуемого материала

Жидкие тестируемые вещества (150 мкл) наносятся на поверхность эпидермиса внутри пробирки (рис. 2). При тестировании твердых материалов на диск наносится достаточное количество твердого вещества, чтобы обеспечить покрытие всей поверхности эпидермиса. Затем поверх твердого вещества добавляют деионизированную воду (150 мкл) и осторожно перемешивают пробирки. Тестируемые вещества должны иметь максимальный контакт с кожей. Для некоторых твердых веществ этого можно достичь путем нагревания до 30 °С для плавления испытуемого вещества или путем измельчения с получением гранулированного материала или порошка.

Для каждого испытуемого вещества используют три диска для кожи. Испытуемые вещества наносят на 24 часа (см. также 1.5.3.4). Испытуемое вещество удаляют промыванием струей водопроводной воды при температуре до 30 °C до тех пор, пока не перестанет удаляться дальнейший материал. Удаление затвердевших в пробирке тестируемых веществ можно облегчить струйной промывкой теплой водой при температуре примерно 30°С.

1.5.3.2. ТЕР измерения

TER измеряется с помощью низковольтного моста передачи данных переменного тока (например, AIM 401 или 6401 или эквивалентного). Перед измерением электрического сопротивления поверхностное натяжение кожи уменьшают путем добавления достаточного объема 70 % этанола, чтобы покрыть эпидермис. Через несколько секунд этанол удаляют, переворачивая пробирку, а затем ткань гидратируют, добавляя 3 мл раствора сульфата магния (154 мМ). Электроды моста данных размещаются по обе стороны кожного диска для измерения сопротивления в кОм/кожный диск (рис. 2). Размеры электрода и длина электрода, выступающего под зажимами-крокодилами, показаны на рисунке 1. Внутренний (толстый) зажим электрода опирается на верхнюю часть трубки из ПТФЭ во время измерения сопротивления, чтобы обеспечить постоянную длину электрода, погруженного в воду. раствор сульфата магния. Внешний (тонкий) электрод располагается внутри рецепторной камеры так, чтобы он опирался на дно камеры. Расстояние между нижней частью пружинного зажима и нижней частью трубки из ПТФЭ поддерживается постоянным (рис. 1), поскольку это расстояние влияет на получаемое значение сопротивления.

Обратите внимание, что если измеренное значение сопротивления превышает 20 кОм, это может быть связано с тем, что тестируемое вещество покрывает эпидермальную поверхность скип-диска. Удалить это покрытие можно, например, запечатав трубку из ПТФЭ большим пальцем в перчатке и встряхивая ее в течение примерно 10 секунд; раствор сульфата магния сливают и измерение сопротивления повторяют со свежим сульфатом магния.

Средние результаты TER принимаются при условии, что одновременные положительные и отрицательные контрольные значения попадают в допустимые диапазоны для метода. Предлагаемые контрольные вещества и связанные с ними приемлемые диапазоны устойчивости для описанной методологии и оборудования:

>ТАБЛИЦА>

1.5.3.3. Модифицированная процедура для поверхностно-активных веществ и нейтральных органических веществ

Если значения TER тестируемых веществ, которые являются поверхностно-активными веществами или нейтральными органическими веществами, меньше или равны 5 кОм, оценку проникновения красителя можно провести на тканях. Эта процедура позволит определить, являются ли результаты ложноположительными (2).

1.5.3.3.1. Нанесение и удаление красителя сульфородамина B

После первоначальной обработки тестируемым веществом 150 мкл 10%-ного (мас./об.) разведения красителя сульфородамина В в дистиллированной воде наносят на эпидермальную поверхность каждого кожного диска на 2 часа. Затем диски кожи промывают под струей водопроводной воды при температуре до комнатной в течение примерно 10 секунд, чтобы удалить избыток/несвязавшийся краситель. Каждый кожный диск осторожно извлекают из ПТФЭ-пробирки и помещают во флакон (например, стеклянный сцинтилляционный флакон емкостью 20 мл), содержащий деионизированную воду (8 мл). Флаконы осторожно перемешивают в течение 5 минут, чтобы удалить избыток/несвязавшийся краситель. Затем эту процедуру промывания повторяют, после чего диски кожи удаляют и помещают во флаконы, содержащие 5 мл 30% (мас./об.) додецилсульфата натрия (ДСН) в дистиллированной воде, и инкубируют в течение ночи при 60°С. После инкубации каждый диск кожи удаляют и выбрасывают, а оставшийся раствор центрифугируют в течение 8 минут при 21°С (относительная центробежная сила [sim] 175). Затем образец надосадочной жидкости объемом 1 мл разбавляют 1 к 5 (по объему) (т.е. 1 мл + 4 мл) 30% (по весу/объему) ДСН в дистиллированной воде. Оптическая плотность (ОП) раствора измеряется примерно при 565 нм.

1.5.3.3.2. Расчет содержания красителя

Содержание красителя сульфородамина Б на диск рассчитывают по значениям ОП (молярный коэффициент экстинкции красителя сульфородамина Б при 565 нм = 8,7 × 104; молекулярная масса = 580). Содержание красителя сульфородамина B определяют для каждого диска кожи, а затем рассчитывают среднее содержание красителя для повторов. Средние результаты связывания красителя принимаются при условии, что значения одновременного контроля находятся в пределах допустимого диапазона для данного метода. Предлагаемые допустимые диапазоны содержания красителей для контрольных веществ для описанной методологии и устройства:

>ТАБЛИЦА>

1.5.3.4. Дополнительная информация

Тестовые вещества также можно наносить на кожные диски на более короткие периоды времени (например, 2 часа) для выявления материалов, обладающих сильной коррозией. Однако в валидационном исследовании было обнаружено, что анализ TER переоценивает коррозионный потенциал некоторых тестируемых химических веществ после их нанесения на кожные диски в течение 2 часов (2), хотя он позволяет правильно идентифицировать коррозионные и некоррозионные вещества после 24 -часовая заявка.

Свойства и размеры испытательной установки, а также использованная методика эксперимента могут влиять на полученные значения TER. Коррозионный порог 5 кОм был разработан на основе данных, полученных с помощью специального оборудования и процедуры, описанной в этом методе. Если условия испытаний существенно изменяются, могут применяться другие пороговые и контрольные значения. Поэтому рекомендуется калибровать методологию и пороговое значение устойчивости путем тестирования серии эталонных стандартов, выбранных из химических веществ, использованных в валидационном исследовании (3).

1.6. Принцип метода испытаний - анализ модели кожи человека

Испытуемый материал наносится местно на срок до 4 часов на трехмерную модель кожи человека, состоящую из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем. Коррозионные материалы идентифицируются по их способности вызывать снижение жизнеспособности клеток (что определяется, например, с помощью анализа снижения МТТ) ниже определенных пороговых уровней в определенные периоды воздействия. Принцип эссе соответствует гипотезе о том, что химические вещества, которые вызывают коррозию, способны проникать в роговой слой (путем диффузии или эрозии) и являются достаточно цитотоксичными, чтобы вызвать гибель клеток в нижележащих слоях клеток.

1.7. Описание метода тестирования - анализ модели кожи человека

1.7.1. Модели кожи человека

Модели кожи человека могут быть получены из разных источников, но они должны соответствовать определенным критериям. Модель должна иметь функциональный роговой слой с подстилающим его слоем живых клеток. Барьерная функция рогового слоя должна быть адекватной. Это можно продемонстрировать, продемонстрировав устойчивость модели к цитотоксичности после применения веществ, которые, как известно, цитотоксичны для клеток, но которые обычно не проходят через роговой слой. Необходимо показать, что модель дает воспроизводимые результаты в определенных экспериментальных условиях.

Жизнеспособность живых клеток в модели должна быть достаточно высокой, чтобы хорошо различать вещества положительного и отрицательного контроля. Жизнеспособность клеток (например, измеренная по степени снижения МТТ, т.е. значению OD) после воздействия вещества отрицательного контроля должна находиться в пределах, допустимых для конкретной модели. Аналогичным образом, значения жизнеспособности клеток с веществом положительного контроля (по сравнению со значениями для отрицательного контроля) должны находиться в установленных пределах. Самое главное, что используемая модель прогнозирования должна быть подтверждена как соответствующая международному стандарту валидации (2).

1.7.2. Тестовая процедура

1.7.2.1. Применение испытуемого материала

Для жидких материалов необходимо нанести достаточное количество тестируемого вещества, чтобы покрыть поверхность кожи (минимум 25 мкл/см2). Для твердых материалов необходимо нанести достаточное количество тестируемого вещества, чтобы оно покрыло кожу, а затем его следует увлажнить, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей; при необходимости твердые вещества перед применением следует измельчить в порошок. Необходимо доказать, что метод применения подходит для широкого спектра химических типов (2). По окончании периода воздействия исследуемый материал необходимо тщательно смыть с поверхности кожи физиологическим раствором.

1.7.2.2. Измерения жизнеспособности клеток

Для измерения жизнеспособности клеток можно использовать любой количественный проверенный метод. Наиболее часто используемым анализом является снижение МТТ, который, как было показано в различных лабораториях, дает точные и воспроизводимые результаты (2). Кожный диск помещают в раствор МТТ 0,3 мг/мл при температуре 20-28°С на 3 часа. Затем экстрагируют осажденный продукт синего формазана (экстракция растворителем) и измеряют концентрацию формазана путем определения оптической плотности при длине волны от 545 до 595 нм.

1.7.2.3. Дополнительная информация

Используемая модель кожи, а также точный протокол времени воздействия, процедур мытья и т. д. будут иметь большое влияние на результаты жизнеспособности клеток. Рекомендуется откалибровать методологию и модель прогнозирования путем тестирования ряда эталонных стандартов, выбранных из химических веществ, использованных в валидационном исследовании ECVAM (3). Крайне важно, чтобы используемый метод был воспроизводим внутри лабораторий и между лабораториями для широкого спектра химических веществ в соответствии с международными стандартами. Как минимум, метод должен соответствовать критериям научной достоверности, определенным ранее (2), а результаты такого проверочного исследования должны быть опубликованы в рецензируемом научном журнале.

2. ДАННЫЕ

2.1. Обработка результатов

2.1.1. TER-анализ кожи крысы

Значения сопротивления (кОм) для испытуемого материала, положительных и отрицательных контролей и любых стандартных эталонных химических веществ следует указывать в табличной форме, включая данные для повторных/повторных экспериментов, средние значения и полученную классификацию.

2.1.2. Эссе модели кожи человека

Значения ОП и рассчитанные процентные данные о жизнеспособности клеток для испытуемого материала, положительных и отрицательных контролей и любых стандартных эталонных химических веществ следует сообщать в табличной форме, включая данные для повторных/повторных экспериментов, средние значения и полученную классификацию.

2.2. Оценка и интерпретация результатов

2.2.1. TER-анализ кожи крысы

Если среднее значение TER, полученное для испытуемого вещества, превышает 5 кОм, то оно не вызывает коррозии. Если значение TER меньше или равно 5 кОм, а испытуемое вещество не является поверхностно-активным веществом или нейтральным органическим веществом, то оно является коррозионным.

Для поверхностно-активных веществ или нейтральных органических веществ, которые дают значения TER меньше или равные 5 кОм, можно провести проникновение красителя. Если среднее содержание красителя на диске больше или равно среднему содержанию красителя на диске в положительном контроле с 36 % HCl, полученном одновременно, то испытуемое вещество является истинно положительным и, следовательно, является коррозионным. Если среднее содержание красителя на диске меньше, чем среднее содержание диска в положительном контроле с 36 % HCl, полученном одновременно, то испытуемое вещество является ложноположительным и, следовательно, не вызывает коррозии.

2.2.2. Анализ модели кожи человека

Значение OD отрицательного контроля представляет собой 100% жизнеспособность клеток; следовательно, значения ОП, полученные для каждого тестируемого образца, можно использовать для расчета процентной жизнеспособности относительно отрицательного контроля. Пороговое процентное значение жизнеспособности клеток, позволяющее отличить коррозионно-активные испытательные материалы от некоррозионных (или различать разные коррозионные классы), должно быть четко определено в модели прогнозирования до валидации метода, а последующее валидационное исследование должно показать, что пороговое значение жизнеспособности клеток должно быть четко определено в модели прогнозирования. значение соответствует (2).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен включать как минимум следующую информацию:

Тестируемое вещество:

- идентификационные данные, физическая природа и, при необходимости, физико-химические свойства. Аналогичная информация должна быть предоставлена ​​и для эталонных веществ, если они используются.

Условия испытаний:

- подробности использованной процедуры испытания,

- описание и обоснование любых изменений.

Полученные результаты:

- табулирование значений устойчивости (анализ TER) или процентных значений жизнеспособности клеток (анализ на модели кожи человека) для тестируемого материала, положительных и отрицательных контролей и любых стандартных эталонных химических веществ, включая данные для повторных/повторных экспериментов и средние значения,

- описание любых других наблюдаемых эффектов.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Больше (1998), Больше новостей и просмотров, Атлас 26, стр. 275-280.

(2) Фентем, Дж.Х., Арчер, Г.Е.Б., Боллс, М., Ботэм, П.А., Каррен, Р.Д., Эрл, Л.К., Эсдейл, Д.Дж., Холжуттер, Х.Г. и Либш, М. (1998), Международное исследование ECVAM по проверке in vitro тестов на разъедающее воздействие на кожу. 2. Результаты и оценка руководства, Токсикология in Vitro 12, стр. 483-524.

(3) Барратт, доктор медицинских наук, Брантом, П.Г., Фентем, Дж.Х., Гернер, И., Уокер, А.П. и Уорт, А.П. (1998), Международное валидационное исследование ECVAM по тестам in vitro на разъедающее воздействие на кожу. 1. Выбор и распространение тестируемых химикатов, Токсикология in Vitro 12, стр. 471-482.

(4) Оливер Г.Дж.А., Пембертон М.А. и Роудс К. (1986), Испытание на коррозионное воздействие кожи in vitro – модификации и валидация, Food & Chemical Toxicology 24, стр. 507-512.

(5) Ботам, П.А., Холл, Т.Дж., Деннетт, Р., МакКолл, Дж.К., Баскеттер, Д.А., Уиттл, Э., Чизмен, М., Эсдейл, Д.Дж. и Гарднер Дж. (1992), Тест на разъедание кожи in vitro: результаты межлабораторного исследования, Токсикология in Vitro 6, стр. 191-194.

(6) Уорт, А.П., Фентем, Дж.Х., Боллс, М., Ботэм, П.А., Каррен, Р.Д., Эрл, Л.К., Эсдейл, Д.Дж. и Либш, М. (1998), Оценка предложенной ОЭСР стратегии испытаний на коррозию кожи, ATLA 26, стр. 709-720.

(7) Ботам, П.А., Чемберлен, М., Баррат, М.Д., Каррен, Р.Д., Эсдейл, Д.Дж., Гарднер, Дж.Р., Гордон, В.К., Хильдебранд, Б., Льюис, Р.В., Либш, М., Логеманн, П. , Осборн Р., Понек М., Ренье Дж. Ф., Стейлинг В., Уокер А. П. и Боллс М. (1995), Предварительное исследование испытаний на коррозионную активность кожи in vitro. Отчет и рекомендации 6-го семинара ECVAM, ATLA 23, стр. 219-255.

Рисунок 1

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.009601.TIF">

фигура 2

>ФАЙЛ PIC="L_2000136EN.009701.TIF">"

ПРИЛОЖЕНИЕ II

«B.41. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ – ТЕСТ НА ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO 3T3 NRU

1. МЕТОД

1.1. Введение

Фототоксичность определяется как токсическая реакция, которая возникает после первого воздействия на кожу определенных химических веществ и последующего воздействия света или аналогичным образом индуцируется облучением кожи после системного введения химического вещества.

Информация, полученная в результате теста на фототоксичность 3T3 NRU in vitro, служит для определения фототоксического потенциала испытуемого вещества, т.е. наличия или отсутствия возможных опасностей, которые могут возникнуть от испытуемого вещества в связи с воздействием УФ-излучения и видимого света.

Поскольку токсикологической конечной точкой теста in vitro является определение фотоцитотоксичности, индуцированной совместным действием химического вещества и света, соединений, фототоксичных in vivo при системном применении и распределении на коже, а также соединений, действующих как фотораздражители при местном применении. при попадании на кожу можно определить с помощью теста.

Тест на фототоксичность 3T3 NRU in vitro был разработан и утвержден в рамках совместного проекта ЕС/COLIPA в 1992-1997 годах (1) (2) (3) с целью создания действенной альтернативы in vitro различным используемым тестам in vivo. В 1996 году семинар ОЭСР рекомендовал подход к тестированию на уровне in vitro для оценки фототоксичности (4).

Результаты теста на фототоксичность 3T3 NRU in vitro сравнивались с эффектами острой фототоксичности/фотораздражения in vivo у животных и людей, и было показано, что этот тест дает превосходную прогнозируемость этих эффектов. Тест не предназначен для прогнозирования других неблагоприятных эффектов, которые могут возникнуть в результате комбинированного действия химического вещества и света, например. фотогенотоксичность, фотоаллергия и фотоканцерогенность, хотя многие химические вещества, которые проявляют эти специфические свойства, будут давать положительную реакцию в тесте на фототоксичность in vitro 3T3 NRU. Кроме того, тест не предназначен для оценки фототоксической активности.

Последовательный подход к тестированию фототоксичности химических веществ изложен в Приложении.

1.2. Определения

Излучение: интенсивность ультрафиолетового (УФ) или видимого света, падающего на поверхность, измеряемая в Вт/м2 или мВт/см2.

Доза света: количество (= интенсивность × время) ультрафиолетового (УФ) или видимого излучения, падающего на поверхность, выраженное в джоулях (= Вт × с) на площадь поверхности, например Дж/м2 или Дж/см2.

Диапазоны волн ультрафиолетового света: обозначения, рекомендованные CIE (Международной комиссией по освещению): UVA (315–400 нм), UVB (280–315 нм) и UVC (100–280 нм). Используются и другие обозначения: разделение между UVB и UVA часто проводится на уровне 320 нм, а UVA можно разделить на UV-A1 и UV-A2 с разделением примерно на 340 нм.

Жизнеспособность клеток: параметр, измеряющий общую активность клеточной популяции (например, поглощение жизненно важного нейтрального красного красителя клеточными лизосомами), который, в зависимости от измеряемой конечной точки и используемого дизайна теста, коррелирует с общим количеством и/или жизнеспособностью клеток.

Относительная жизнеспособность клеток: жизнеспособность клеток, выраженная по отношению к отрицательным контролям (растворителям), которые прошли всю процедуру испытания (+ УФ или - УФ), но не обработаны тестируемым химическим веществом.

Модель прогнозирования: алгоритм, используемый для преобразования результатов теста на токсичность в прогноз токсического потенциала. В настоящем руководстве по тестированию PIF и MPE могут использоваться для преобразования результатов теста фототоксичности 3T3 NRU in vitro в прогноз фототоксического потенциала.

PIF (фактор фотораздражения): фактор, создаваемый путем сравнения двух одинаково эффективных цитотоксических концентраций (EC50) тестируемого химического вещества, полученных в отсутствие (- УФ) и в присутствии (+ УФ) нецитотоксического облучения с УФА/видимым излучением. свет.

MPE (средний фотоэффект): новый показатель, полученный на основе математического анализа полной формы двух кривых реакции концентрации, полученных в отсутствие (- УФ) и в присутствии (+ УФ) нецитотоксического облучения УФА/видимым светом.

Фототоксичность: острая токсическая реакция, которая возникает после первого воздействия на кожу определенных химических веществ и последующего воздействия света или аналогичным образом индуцируется облучением кожи после системного введения химического вещества.

Фотораздражение: подвид термина «фототоксичность», который используется для описания только тех фототоксических реакций, которые возникают на коже после воздействия химических веществ (местно или перорально). Эти фотоксические реакции всегда приводят к неспецифическому повреждению клеток (реакции, подобные солнечному ожогу).

Фотоаллергия: приобретенная иммунологическая реактивность, которая не возникает при первом лечении химическими веществами и светом и требует индукционного периода в одну или две недели, прежде чем можно будет продемонстрировать реактивность кожи.

Фотогенотоксичность: генотоксический ответ, наблюдаемый с генетической конечной точкой, который возникает после воздействия на клетки негенотоксичной дозы УФ/видимого света и негенотоксичного химического вещества.

Фотоканцерогенность: канцерогенность, вызванная повторным воздействием света и химикатов. Термин «фотококарциногенез» используется, если индуцированный УФ-излучением туморогенез усиливается химическим веществом.

1.3. Эталонные вещества

Помимо химического вещества положительного контроля хлорпромазина, который следует тестировать одновременно в каждом анализе, для нового проведения теста на фототоксичность 3T3 NRU рекомендуется использовать в качестве эталонных химических веществ подмножество химических веществ, использованных в межлабораторных исследованиях с настоящим тестом (1) (3). (13).

1.4. Первоначальные соображения

Сообщалось, что многие типы химических веществ вызывают фототоксические эффекты (5) (6) (7) (8). Единственной общей чертой является их способность поглощать световую энергию в пределах области солнечного света. Согласно первому закону фотохимии (закону Гроттхауса-Дрейпера) фотореакция требует достаточного поглощения квантов света. Таким образом, прежде чем рассматривать биологическое тестирование в соответствии с настоящим Руководством по испытаниям, следует определить спектр поглощения УФ/видимого вещества испытуемого химического вещества (например, в соответствии с Руководством по испытаниям ОЭСР 101). Если молярный коэффициент экстинкции/поглощения составляет менее 10 л × моль-1 × см-1, химическое вещество не имеет фотореактивного потенциала и его не нужно тестировать в тесте на фототоксичность in vitro 3T3 NRU или в любом другом биологическом тесте на предмет неблагоприятных фотохимических реакций. эффекты (Приложение).

1,5. Принцип метода испытаний

Были идентифицированы четыре механизма, посредством которых поглощение света (химическим) хромофором может привести к фототоксической реакции (7). Все они приводят к повреждению клеток. Таким образом, тест на фототоксичность 3T3 NRU in vitro основан на сравнении цитотоксичности химического вещества при тестировании в присутствии и в отсутствие воздействия нецитотоксичной дозы УФА/видимого света. Цитотоксичность в этом тесте выражается как зависящее от концентрации снижение поглощения жизненно важного красителя нейтрального красного (NR) (9) через 24 часа после обработки тестируемым химическим веществом и облучения.

Клетки Balb/c 3T3 выдерживают в культуре в течение 24 ч для формирования монослоев. Затем два 96-луночных планшета на каждое исследуемое химическое вещество предварительно инкубируют с восемью различными концентрациями химического вещества в течение 1 часа. После этого одна из двух пластин подвергается воздействию нецитотоксичной дозы УФА/видимого света 5 Дж/см2 УФА (эксперимент + УФ), тогда как другую пластину оставляют в темноте (эксперимент - УФ). Затем в обеих чашках обрабатывающую среду заменяют культуральной средой, и еще через 24 часа инкубации определяют жизнеспособность клеток по поглощению нейтрального красного (NRU) в течение 3 часов. Относительная жизнеспособность клеток, выраженная в процентах от необработанных отрицательных контролей, рассчитывается для каждой из восьми тестовых концентраций. Для прогнозирования фототоксического потенциала сравнивают концентрационные реакции, полученные в присутствии (+УФ) и в отсутствие (-УФ) облучения, обычно на уровне EC50, т.е. при концентрации, ингибирующей жизнеспособность клеток на 50 % ср. необработанные элементы управления.

1.6. Критерии качества

Чувствительность клеток к UVA, исторические данные: клетки следует регулярно проверять на чувствительность к UVA. Клетки высевают с плотностью, используемой в тесте фототоксичности 3T3 NRU in vitro, на следующий день облучают дозами UVA от 1-9 Дж/см2, а жизнеспособность клеток определяют через день с помощью анализа NRU. Клетки соответствуют критериям качества, если их жизнеспособность после облучения УФА 5 Дж/см2 составляет не менее 80 % жизнеспособности темнового контроля. При самой высокой дозе УФ-А, равной 9 Дж/см2, жизнеспособность должна быть не менее 50 % от таковой у темнового контроля. Эту проверку следует повторять примерно при каждом 10-м пассаже клеток.

Чувствительность к UVA клеток отрицательного контроля, текущий тест: тест соответствует критериям качества, если отрицательный контроль (клетки в сбалансированном солевом растворе Эрла (EBSS) с 1 % диметилсульфоксида (ДМСО) или 1 % этанола (EtOH)) или без него в + Эксперименты с UVA показывают жизнеспособность не менее 80% от жизнеспособности необлученных клеток в том же растворителе, что и в параллельном темном эксперименте (- UVA).

Жизнеспособность отрицательных контролей: абсолютная оптическая плотность (OD540 NRU), измеренная в экстракте NR отрицательного контроля, показывает, выросли ли 1 × 104 клеток, высеянных на лунку, с нормальным временем удвоения в течение двух дней анализа. Тест соответствует критериям приемлемости, если среднее значение OD540 NRU необработанных контролей составляет >= 0,2.

Положительный контроль: известное фототоксичное химическое вещество должно быть проверено одновременно с каждым тестом на фототоксичность in vitro 3T3 NRU. Хлорпромазин (CPZ) использовался в качестве положительного контроля в валидационном исследовании EU/COLIPA и поэтому рекомендуется. Для CPZ, испытанного по стандартному протоколу в тесте на фототоксичность in vitro 3T3 NRU, были определены следующие критерии приемлемости теста: CPZ облученный (+ UVA): EC50 = от 0,1 до 2,0 мкг/мл, CPZ необлученный (- UVA): EC50 = от 7,0 до 90,0 мкг/мл. Фактор фотораздражения (PIF), т.е. сдвиг EC50, должен быть не менее 6.

Вместо CPZ в качестве одновременного положительного контроля можно использовать другие известные фототоксичные химикаты, подходящие для химического класса или характеристик растворимости оцениваемого тестируемого химиката. В этом случае, основываясь на исторических данных, диапазоны значений EC50 и PIF или MPE (средний фотоэффект) должны быть адекватно определены в качестве критериев приемлемости для испытания.

1.7. Описание метода испытаний

1.7.1. Препараты

1.7.1.1. Клетки

В валидационном исследовании использовалась постоянная клеточная линия мышиных фибробластов - Balb/c 3T3, клон 31 - либо из ATCC, либо из ECACC, и поэтому она рекомендуется. Другие клетки или клеточные линии можно успешно использовать по тому же протоколу испытаний, если условия культивирования адаптированы к конкретным потребностям клеток, но необходимо продемонстрировать эквивалентность.

Клетки следует регулярно проверять на отсутствие контаминации микоплазмой и использовать только в том случае, если результаты такой проверки являются удовлетворительными.

Поскольку чувствительность клеток к УФ-А может увеличиваться с увеличением количества пассажей, следует использовать клетки Balb/c 3T3 с наименьшим возможным числом пассажей, предпочтительно менее 100. Важно регулярно проверять чувствительность к УФ-А клеток Balb/c 3T3. в соответствии с процедурой контроля качества, описанной в настоящем руководстве.

1.7.1.2. Медиа и культурные условия

Для рутинного пассажа клеток и во время процедуры тестирования следует использовать соответствующие культуральные среды и условия инкубации. Для клеток Balb/c 3T3 это DMEM с добавлением 10% сыворотки новорожденных теленка, 4 мМ глутамина, пенициллина и стрептомицина; и увлажненная инкубация при 37 °C/7,5 % CO2. Особенно важно, чтобы условия культивирования клеток обеспечивали время клеточного цикла в пределах нормального исторического диапазона используемых клеток или клеточной линии.

1.7.1.3. Подготовка культур

Клетки из замороженных исходных культур высевают в культуральную среду соответствующей плотности и субкультивируют по крайней мере один раз перед использованием в тесте на фототоксичность 3T3 NRU in vitro.

Для теста на фототоксичность клетки высевают в культуральную среду с такой плотностью, чтобы культуры не достигли слияния к концу теста, т.е. когда жизнеспособность клеток определяют через 48 часов после посева клеток. Для клеток Balb/c 3T3, выращенных в 96-луночных планшетах, рекомендуемая плотность клеток составляет 1 × 104 клеток на лунку.

Для каждого тестируемого химического вещества клетки высевают одинаково в два отдельных 96-луночных планшета, которые затем обрабатывают одновременно на протяжении всей процедуры тестирования в идентичных условиях культивирования, за исключением периода времени, когда один из планшетов подвергается облучению (+ UVA/видимая видимая область спектра). а другой хранится в темноте (- UVA/vis).

1.7.1.4. Метаболическая активация

В то время как использование метаболизирующих систем является общим требованием для всех тестов in vitro для прогнозирования генотоксического и канцерогенного потенциала, до сих пор в случае фототоксикологии не известно ни одного химического вещества, для которого необходима метаболическая трансформация, чтобы химическое вещество действовало как фототоксин in vivo или in vitro. Таким образом, проведение настоящего теста с системой метаболической активации не считается ни необходимым, ни научно обоснованным.

1.7.1.5. Испытательный химикат/препарат

Испытуемые химикаты должны быть свежеприготовлены непосредственно перед использованием, если только данные о стабильности не свидетельствуют о приемлемости хранения. Подготовка под красным светом может потребоваться, если существует вероятность быстрого фотодеградации.

Испытуемые химикаты следует растворять в забуференных солевых растворах, например Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) или фосфатно-солевой буфер (PBS), который, чтобы избежать помех во время облучения, не должен содержать белковых компонентов и светопоглощающих цветов-индикаторов pH.

Испытательные химикаты с ограниченной растворимостью в воде следует растворить в соответствующих растворителях в 100-кратной желаемой конечной концентрации, а затем разбавить в соотношении 1:100 забуференным раствором соли. Если используется растворитель, он должен присутствовать в постоянном объеме 1 % (по объему) во всех культурах, т. е. в отрицательном контроле, а также во всех концентрациях тестируемого химиката.

Рекомендуемыми растворителями являются диметилсульфоксид (ДМСО) и этанол (EtOH). Могут подойти и другие растворители с низкой цитотоксичностью (например, ацетон), но их следует тщательно оценить на предмет специфических свойств, например: реакция с исследуемым химикатом, подавление фототоксического эффекта, свойства улавливания радикалов.

При необходимости для облегчения солюбилизации можно использовать вихревое перемешивание и/или обработку ультразвуком и/или нагревание до 37°C.

1.7.1.6. УФ-облучение/препарат

Источник света: выбор подходящего источника света и соответствующей фильтрации является наиболее важным фактором при тестировании на фототоксичность. UVA и видимые области обычно связаны с фотосенсибилизацией (7) (10), тогда как UVB имеет меньшее значение и напрямую обладает высокой цитотоксичностью, увеличивая свою цитотоксичность в 1000 раз с 313 до 280 нм (11). Критерии выбора подходящего источника света должны включать существенное требование, чтобы источник света излучал длины волн, поглощаемые тестируемым химическим веществом, и чтобы доза света (достижимая за разумное время) была достаточной для обнаружения известных фотосенсибилизаторов. Кроме того, используемые длины волн и дозы не должны быть чрезмерно вредными для испытательной системы, включая излучение тепла (инфракрасная область).

Имитация солнечного света с помощью солнечных имитаторов считается оптимальным источником света. В имитаторах солнечной энергии используются как ксеноновые дуги, так и (легированные) ртутно-металлогалогенные дуги. Последние имеют то преимущество, что выделяют меньше тепла и дешевле, но их совместимость с солнечным светом не идеальна. Поскольку все солнечные симуляторы излучают значительные количества УФ-В, их следует соответствующим образом фильтровать, чтобы ослабить высокоцитотоксичные длины волн УФ-В.

Для теста фототоксичности 3T3 NRU in vitro следует использовать спектр излучения, практически лишенный УФВ (UVA:UVB [sim] 1:20). Был опубликован пример спектрального распределения излучения фильтрованного солнечного имитатора, использованного в валидационном исследовании теста фототоксичности 3T3 NRU in vitro (3).

Дозиметрия: интенсивность света (облученность) следует регулярно проверять перед каждым испытанием на фототоксичность с помощью подходящего широкополосного УФ-метра. УФ-метр должен быть откалиброван по источнику. Работоспособность УФ-метра следует проверить, для чего рекомендуется использовать второй эталонный УФ-метр того же типа и идентичной калибровки. В идеале, через большие промежутки времени следует использовать спектрорадиометр для измерения спектральной освещенности источника отфильтрованного света и проверки калибровки широкополосного УФ-метра, но такие приборы требуют квалифицированного управления соответствующим образом обученным персоналом.

В ходе валидационного исследования было установлено, что доза 5 Дж/см2 (УФ-А) не является цитотоксичной для клеток Balb/c 3T3 и достаточно эффективна для возбуждения даже слабых фототоксичных химических веществ. Для достижения 5 Дж/см2 в течение 50 минут интенсивность излучения необходимо довести до 1666 мВт/см2. Если используется другая клеточная линия или другой источник света, дозу UVA, возможно, придется немного адаптировать, используя критерии невредности для клеток и достаточности для обнаружения стандартных фототоксинов. Время воздействия света рассчитывается следующим образом:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.010101.EPS">

1.7.2. Условия испытаний

Максимальная концентрация тестируемого химического вещества не должна превышать 100 мкг/мл, поскольку все фототоксичные химические вещества обнаруживаются при более низких концентрациях, тогда как при более высоких концентрациях увеличивается частота ложноположительных результатов (завышенных прогнозов) (13). Уровень pH самой высокой концентрации тестируемого химиката должен быть удовлетворительным (диапазон pH: 6,5–7,8).

Диапазоны концентраций химического вещества, тестируемого в присутствии (+ UVA) и в отсутствие (- UVA) света, должны быть адекватно определены в предыдущих экспериментах с дальномером. Диапазон и точка пересечения ряда концентраций должны быть отрегулированы таким образом, чтобы кривые концентрация-реакция в достаточной степени подтверждались экспериментальными данными. Следует использовать ряды геометрических концентраций (с постоянным коэффициентом разбавления).

1.7.3. Процедура испытания(1)

1.7.3.1. Первый день

Приготовьте клеточную суспензию с концентрацией 1 × 1055 клеток/мл в культуральной среде и внесите 100 мкл культуральной среды только в периферические лунки 96-луночного микротитровального планшета для тканевых культур (= бланки). В оставшиеся лунки внесите по 100 мкл клеточной суспензии из расчета 1 × 105 клеток/мл (= 1 × 104 клеток/лунку). Для каждого тестируемого химического вещества подготовьте две пластины: одну для определения цитотоксичности (- UVA), а другую для определения фотоцитотоксичности (+ UVA).

Инкубируйте клетки в течение 24 часов (7,5 % CO2, 37 °C), пока они не образуют полусливающийся монослой. Этот инкубационный период обеспечивает восстановление и прикрепление клеток, а также экспоненциальный рост.

1.7.3.2. Второй день

После инкубации сливают культуральную среду с клеток и дважды промывают 150 мкл EBSS/PBS на лунку. Добавьте 100 мкл EBSS/PBS, содержащего соответствующую концентрацию тестируемого химиката или просто растворителя (отрицательный контроль). Примените 8 различных концентраций тестируемого химиката. Инкубируйте клетки с тестируемым химикатом в темноте в течение 60 минут (7,5 % CO2, 37 °C).

Для выполнения части анализа (+ UVA) облучайте клетки при комнатной температуре в течение 50 минут через крышку 96-луночного планшета УФА мощностью 1,7 мВт/см2 (= 5 Дж/см2). Проветривайте вентилятором, чтобы предотвратить конденсацию H2O под крышкой. Храните дубликаты пластин (- UVA) при комнатной температуре в темном ящике в течение 50 минут (= время воздействия UVA).

Декантируйте тестируемый раствор и дважды промойте 150 мкл EBSS/PBS. Замените EBSS/PBS культуральной средой и инкубируйте (7,5% CO2, 37 °C) в течение ночи (18-22 часа).

1.7.3.3. Третий день

Микроскопическая оценка

Изучите клетки под фазово-контрастным микроскопом. Запишите изменения в морфологии клеток вследствие цитотоксического действия тестируемого химического вещества. Данная проверка рекомендуется для исключения экспериментальных ошибок, но эти записи не используются для оценки цитотоксичности или фототоксичности.

Тест на усвоение нейтрального красного

Промойте клетки 150 мкл подогретого EBSS/PBS. Удалите моющий раствор легким постукиванием. Добавьте 100 мкл среды NR и инкубируйте при 37 °C, во влажной атмосфере с 7,5 % CO2, в течение 3 часов.

После инкубации удалите среду NR и промойте клетки 150 мкл EBSS/PBS. Декантируйте и полностью промокните EBSS/PBS. (Дополнительно: центрифуга с перевернутым планшетом.)

Добавьте ровно 150 мкл десорбирующего раствора NR (свежеприготовленный этанол/уксусная кислота).

Быстро встряхивайте микротитровальный планшет на шейкере для микротитровальных планшетов в течение 10 мин до тех пор, пока NR не будет экстрагирован из клеток и не образует гомогенный раствор.

Измерьте оптическую плотность экстракта NR при 540 нм в спектрофотометре, используя бланки в качестве эталона. Сохраните данные в соответствующем формате файла (например, ASCII) для последующего анализа.

2. ДАННЫЕ

2.1. Качество и количество данных

Данные должны позволить провести значимый анализ реакции концентрации, полученной в присутствии и в отсутствие УФА/Видимого облучения. Если обнаружена цитотоксичность, как диапазон концентраций, так и точка пересечения отдельных концентраций должны быть установлены таким образом, чтобы обеспечить соответствие кривой экспериментальным данным. В связи с тем, что тестируемое химическое вещество может быть не цитотоксичным до определенной предельной концентрации 100 мкг/мл в темном эксперименте (- UVA), но высоко цитотоксичным при облучении (+ UVA), диапазоны концентраций, подлежащие тестированию как в части эксперимента, возможно, должны отличаться на порядки, чтобы соответствовать требованию адекватного качества данных. Если цитотоксичность не обнаружена в обеих частях эксперимента (- UVA и + UVA), достаточно тестирования с большим интервалом между разовыми дозами вплоть до самой высокой концентрации.

Требований по подтверждению четкого положительного результата путем проведения повторного эксперимента не требуется. Кроме того, нет необходимости проверять явные отрицательные результаты при условии, что тестируемое химическое вещество было протестировано в достаточно высоких концентрациях. В таких случаях достаточно одного основного эксперимента, подкрепленного одним или несколькими предварительными экспериментами по определению диапазона.

Тесты с пограничными результатами, близкими к границе модели прогнозирования, следует повторить для проверки.

Если повторное тестирование считается необходимым, то для достижения четкого результата может оказаться важным изменение условий эксперимента. Ключевой переменной в этом тесте является приготовление растворов тестируемого химиката. Следовательно, изменение этих условий (сорастворитель, растирание, обработка ультразвуком) может быть наиболее важным при повторении теста. В качестве альтернативы можно рассмотреть возможность изменения времени инкубации перед облучением. Более короткое время может быть актуальным для неустойчивых к воде химикатов.

2.2. Обработка результатов

Там, где это возможно, определяют концентрацию тестируемого химического вещества, отражающую 50%-ное ингибирование клеточного NRU (EC50). Это можно сделать, применив любую подходящую процедуру нелинейной регрессии (предпочтительно функцию Хилла или логистическую регрессию) к данным реакции концентрации или используя другие процедуры подбора (14). Прежде чем использовать EC50 для дальнейших расчетов, необходимо соответствующим образом проверить качество посадки. В качестве альтернативы для расчета EC50 можно использовать методы графической аппроксимации. В этом случае рекомендуется использовать вероятностную бумагу (шкала x: логарифм, шкала y: пробит), так как во многих случаях функция отклика концентрации станет почти линейной после этого преобразования.

2.3. Оценка результатов (модели прогнозирования)

2.3.1. Модель прогнозирования, версия 1: фактор фотораздражения (PIF)

Если получены полные кривые реакции концентрации как в присутствии (+ UVA), так и в отсутствие (- UVA) света, то коэффициент фотораздражения (PIF) рассчитывается по следующей формуле:

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.010301.EPS">

PIF < 5, предсказывает отсутствие фототоксического потенциала, тогда как PIF >= 5 предсказывает фототоксический потенциал.

Если химическое вещество является только цитотоксичным + UVA и не является цитотоксичным при тестировании - UVA, PIF не может быть рассчитан, хотя это результат, указывающий на фототоксический потенциал. В таких случаях ' > PIF' можно рассчитать, если тест на цитотоксичность (- УФ) проводят до самой высокой тестируемой концентрации (Cmax), и это значение используют для расчета ' > ПИФ';

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.010302.EPS">

Если только ' > PIF' может быть получен, тогда любое значение > 1 прогнозирует фототоксический потенциал.

Если невозможно рассчитать EC50 (- УФ) и EC50 (+ УФ) из-за того, что химическое вещество не проявляет цитотоксичности вплоть до самой высокой тестируемой концентрации, это указывает на отсутствие фототоксического потенциала. В таких случаях для характеристики результата используется формальное выражение «PIF = *1»;

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.010303.EPS">

Если можно получить только «PIF = *1», это указывает на отсутствие фототоксического потенциала.

В случаях (b) и (c) при прогнозировании фототоксического потенциала следует тщательно учитывать концентрации, достигнутые в тесте на фототоксичность 3T3 NRU in vitro.

2.3.2. Модель прогнозирования, версия 2: эффект средней фотографии (MPE)

В качестве альтернативы можно применить новую версию модели для прогнозирования фототоксического потенциала, которая была разработана с использованием данных валидационного исследования EU/COLIPA (15) и протестирована в слепых условиях в последующем исследовании фототоксичности УФ-фильтра in vitro. химикаты (13). Эта модель преодолевает ограничения модели PIF в тех случаях, когда невозможно получить EC50. В модели используется «средний фотоэффект» (MPE), показатель, основанный на сравнении полных кривых реакции концентрации. Для применения модели MPE в Университете Гумбольдта (Берлин) разработано специальное компьютерное программное обеспечение, которое можно получить бесплатно.

2.4. Интерпретация результатов

Положительный результат теста на фототоксичность 3T3 NRU in vitro (PIF >= 5 или MPE >= 0,1) свидетельствует о том, что испытуемое вещество обладает фототоксическим потенциалом. Если этот результат получен при концентрациях ниже 10 мкг/мл, тестируемое химическое вещество, скорее всего, также будет действовать как фототоксин при различных условиях воздействия in vivo. Если положительный результат получен только при самой высокой тестовой концентрации 100 мкг/мл, могут потребоваться дополнительные соображения для оценки опасности или фототоксической активности. Они могут включать данные о проникновении, абсорбции и возможном накоплении химического вещества в коже или тестирование химического вещества в подтверждающем альтернативном тесте, например. с использованием модели кожи человека in vitro.

Отрицательный результат теста на фототоксичность 3T3 NRU in vitro (PIF<5 или MPE<0,1) указывает на то, что тестируемое вещество не было фототоксичным для культивируемых клеток млекопитающих в используемых условиях. В тех случаях, когда химическое вещество может быть протестировано до максимальной концентрации 100 мкг/мл, отрицательный результат указывает на то, что химическое вещество не обладает фототоксическим потенциалом, и фототоксичность in vivo можно считать маловероятной. В тех случаях, когда идентичные реакции концентрация-токсичность (EC50 + UV и EC50-UV) были получены при более низких концентрациях, интерпретация данных будет такой же. Напротив, если токсичность не была продемонстрирована (+ УФ и - УФ) и если растворимость в воде ограничивает концентрации до значений менее 100 мкг/мл, то совместимость тестируемого вещества с анализом может быть поставлена ​​под сомнение и следует рассмотреть возможность проведения подтверждающего тестирования (например, с использованием модели кожи in vitro, модели кожи ex vivo или теста in vivo).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Испытательное химическое вещество:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен,

- физическая природа и чистота,

- физико-химические свойства, имеющие значение для проведения исследования,

- стабильность и фотостабильность, если они известны.

Растворитель:

- обоснование выбора растворителя,

- растворимость испытуемого химиката в этом растворителе,

- процентное содержание растворителя в обрабатывающей среде (EBSS или PBS).

Ячейки:

- тип и источник клеток,

- отсутствие микоплазмы,

- количество клеточных пассажей, если известно,

- Чувствительность клеток к UVA, определенная с помощью облучательного оборудования, используемого в тесте на фототоксичность in vitro 3T3 NRU.

Условия испытаний (а) – инкубация до и после обработки:

- тип и состав питательной среды,

- условия инкубации (концентрация CO2, температура, влажность),

- продолжительность инкубации (до лечения, после лечения).

Условия испытаний (b) – обработка химикатом:

- обоснование выбора концентраций испытуемого химического вещества, используемого как в присутствии, так и в отсутствие УФ/видимого облучения,

- в случае ограниченной растворимости тестируемого химического вещества и отсутствия цитотоксичности, обоснование самой высокой тестируемой концентрации,

- тип и состав обрабатывающей среды (буферный солевой раствор),

- продолжительность химической обработки.

Условия испытаний (с) – облучение:

- обоснование выбора используемого источника света,

- спектральные характеристики излучения источника света,

- характеристики пропускания/поглощения используемого фильтра(ов),

- характеристики радиометра и сведения о его калибровке,

- расстояние источника света от испытательной системы,

- излучение UVA на этом расстоянии, выраженное в мВт/см2,

- продолжительность воздействия УФ/видимого света,

- доза UVA (облученность × время), выраженная в Дж/см2,

- температура, применяемая к культурам клеток во время облучения, а также к культурам клеток, одновременно находящимся в темноте.

Условия испытаний (d) – испытание НИУ:

- состав среды NR,

- продолжительность инкубации НР,

- условия инкубации (концентрация CO2, температура, влажность),

- условия экстракции НР (экстрагент, продолжительность),

- длина волны, используемая для спектрофотометрического считывания оптической плотности NR,

- вторая длина волны (эталонная), если она используется,

- бланк спектрофотометра содержания, если он используется.

Полученные результаты:

- жизнеспособность клеток, полученная при каждой концентрации тестируемого химиката, выраженная в процентах от средней жизнеспособности контролей,

- кривые концентрация-реакция (концентрация тестируемого химического вещества против относительной жизнеспособности клеток), полученные в одновременных экспериментах + UVA и - UVA,

- анализ данных кривых зависимости концентрации: если возможно, расчет/расчет EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA),

- сравнение двух кривых реакции концентрации, полученных в присутствии и в отсутствие УФА/видимого облучения, либо путем расчета коэффициента фотораздражения (PIF), либо путем расчета среднего фотоэффекта (MPE),

- классификация фототоксического потенциала,

- критерии приемлемости теста (а) - одновременный отрицательный контроль:

- абсолютная жизнеспособность (оптическая плотность экстракта НР) облученных и необлученных клеток,

- исторические данные отрицательного контроля, среднего и стандартного отклонения.

- критерии приемлемости теста (b) - одновременный положительный контроль:

- EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA) и PIF химиката положительного контроля,

- исторические данные о химическом веществе положительного контроля: EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA) и PIF, среднее и стандартное отклонение.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Шпильманн, Х., Боллс, М., Деринг, Б., Хольцхюттер, Х.Г., Калвейт, С., Клечак, Г., Л'Эплаттеньер, Х., Либш, М., Ловелл, В.В., Маурер, Т., Молденхауэр Ф., Мур Л., Пейп В., Пфаннбекер У., Поттаст Дж., Де Сильва О., Стейлинг В. и Уиллшоу А. (1994), EEC/COLIPA проект по тестированию фототоксичности in vitro: первые результаты, полученные с помощью анализа фототоксичности клеток Balb/c 3T3, Токсикология in Vitro 8, стр. 793-796.

(2) Anon (1998), Заявление о научной достоверности теста 3T3 NRU PT (тест на фототоксичность in vitro), Европейская комиссия, Объединенный исследовательский центр: ECVAM и DGXI/E/2, 3 ноября 1997 г., ATLA 26, стр. 7-8.

(3) Шпильман, Х., Боллс, М., Дюпюи, Ж., Папе, В.Дж.В., Пехович, Г., Де Сильва, О., Хольцхюттер, Х.Г., Клотье, Р., Десоль, П., Герберик, Ф. ., Либш М., Ловелл В.В., Маурер Т., Пфанненбекер У., Поттаст Дж.М., Чато М., Сладовски Д., Стейлинг В. и Брантом П. (1998), EU/ Исследование COLIPA «Фототоксичность in vitro», результаты фазы II (слепое исследование), часть 1: тест на фототоксичность 3T3 NRU, Токсикология in Vitro 12, стр. 305-327.

(4) Программа разработки руководств ОЭСР, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Заключительный отчет семинара ОЭСР по гармонизации критериев валидации и приемлемости альтернативных токсикологических методов испытаний, Офис публикаций ОЭСР, Париж, 1996 г.

(5) Ловелл, В.В. (1993), Схема скрининга веществ in vitro на фотоаллергенный потенциал, Токсикология in Vitro 7, стр. 95-102.

(6) Сантамария Л. и Прино Г. (1972), Список фотодинамических веществ, Ход исследований в области органической, биологической и медицинской химии, Том. 3 Часть 1, North Holland Publishing Co, Амстердам, стр. XI-XXXV.

(7) Шпильман Х., Ловелл В.В., Хёльцле Э., Джонсон Б.Е., Маурер Т., Миранда М.А., Пейп В.Дж.В., Сапора О. и Сладовски Д. (1994), Фототоксичность in vitro. тестирование: Отчет и рекомендации второго семинара ECVAM, ATLA 22, стр. 314-348.

(8) Спайкс, Дж.Д. (1989), Фотосенсибилизация, Наука фотобиологии, под редакцией К.С. Смита, Plenum Press, Нью-Йорк, 2-е издание, стр. 79-110.

(9) Боренфройнд Э. и Пуэрнер Дж.А. (1985), Определение токсичности in vitro по морфологическим изменениям и поглощению нейтрального красного, Toxicology Letters 24, стр. 119-124.

(10) Ламберт Л. А., Уорнер В. Г. и Корнхаузер А. (1996), Модели животных для испытаний на фототоксичность, Дерматотоксикология, под редакцией Ф. Н. Марзулли и Х. И. Майбаха, опубликовано Тейлором и Фрэнсисом, Вашингтон, округ Колумбия, 5-е издание, стр. 515- 530.

(11) Тиррелл Р.М. и Pidoux M (1987), Спектры действия клеток кожи человека: оценки относительной цитотоксичности среднего ультрафиолета, ближнего ультрафиолета и фиолетовых областей солнечного света на эпидермальные кератиноциты, Cancer Research 47, стр. 1825-1829.

(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Стандартная рабочая процедура: Испытание на фототоксичность Balb/c 3T3 NRU, разработанное 23 декабря 1997 г. М. Либшем и одобренное 6 марта 1998 г. руководящей группой проекта ЕС/COLIPA «Фотораздражение in vitro».

(13) Шпильман, Х., Боллс, М., Дюпюи, Дж., Пейп, В.Дж.В., Де Сильва, О., Хольцхюттер, Х.Г., Герберик, Ф., Либш, М., Ловелл, В.В. и Пфанненбекер (1998) , Исследование фототоксичного потенциала химикатов УФ-фильтров из Приложения VII Директивы ЕС 76/768/EEC в тесте на фототоксичность 3T3 NRU In Vitro, ATLA 26, стр. 679-708.

(14) Хольцхюттер Х.Г. и Кведенау Дж. (1995), Математическое моделирование клеточных ответов на внешние сигналы, Журнал биологических систем 3, стр. 127-138.

(15) Хольжюттер, Х.Г. (1997), Общая мера фототоксичности in vitro, полученная на основе пар кривых «доза-реакция», и ее использование для прогнозирования фототоксичности химических веществ in vivo, ATLA 25, стр. 445-462.

Приложение

>ФАЙЛ PIC= "L_2000136EN.010702.TIF">"

(1) Дополнительную информацию можно найти в ссылке 12.