Директива Комиссии 80/891/EEC от 25 июля 1980 г., касающаяся метода анализа Сообщества для определения содержания эруковой кислоты в маслах и жирах, предназначенных для использования как таковых для потребления человеком, и пищевых продуктах, содержащих добавленные масла или жиры.
относится к методу анализа Сообщества для определения содержания эруковой кислоты в маслах и жирах, предназначенных для использования как таковых для потребления человеком, и пищевых продуктах, содержащих добавленные масла или жиры
(80/891/EEC)
КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ
Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,
Принимая во внимание Директиву Совета 76/621/EEC от 20 июля 1976 г., касающуюся установления максимального уровня эруковой кислоты в маслах и жирах, предназначенных как таковые для потребления человеком, а также в пищевых продуктах, содержащих добавленные масла или жиры (1), и в частности Статья 3 этого закона,
Принимая во внимание, что статья 2 Директивы 76/621/EEC предусматривает, что с 1 июля 1979 года содержание эруковой кислоты в продуктах, упомянутых в статье 1 этой Директивы, рассчитанное на общий уровень жирности кислоты в жировом компоненте не может быть более 5 %;
Принимая во внимание, что статья 3 Директивы 76/621/EEC предусматривает, что содержание эруковой кислоты должно определяться методом анализа Сообщества;
Принимая во внимание, что Регламент (ЕЭС) № 1470/68 от 23 сентября 1968 г. о взятии и уменьшении проб и определении содержания масла, примесей и влаги в масличных семенах (2), указанный в Приложении VI, как это введено Регламентом (ЕЭС) ) Нет 72/77 (3) - способ анализа определения содержания эруковой кислоты в семенах рапса и рапса; тогда как этот метод следует использовать в качестве метода проверки;
Принимая во внимание, что при анализе жирных кислот масел и жиров с помощью газожидкостной хроматографии в нормальных условиях невозможно отличить эруковую кислоту от других изомеров докозеновой кислоты, таких как цетоленовая кислота;< /п>
При этом необходимо определение уровня эруковой кислоты в маслах и жирах, а также в пищевых продуктах, в которые добавлены масла или жиры, которые могут содержать цетоленовую кислоту и другие изомеры докозеновой кислоты;
При этом нет необходимости определять уровень эруковой кислоты в маслах и жирах, а также в пищевых продуктах, в которые были добавлены масла или жиры, если после использования методов скринингового анализа обнаружено, что они не содержат более более 5 % общего количества докозеновых кислот или цис-докозеновых кислот;
Принимая во внимание, что в ожидании внедрения усовершенствованного метода анализа для определения эруковой кислоты этот метод анализа считается наиболее подходящим в настоящее время;
Принимая во внимание, что меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по продуктам питания,
ПРИНЯЛ ЭТУ ДИРЕКТИВУ:
Статья 1
Государства-члены должны требовать, чтобы анализ, необходимый для определения содержания эруковой кислоты в продуктах, указанных в статье 1 Директивы 76/621/EEC, проводился, как указано в статье 2.< /п>
Статья 2
1. В целях проверки должно быть определено одно из следующих значений:
<тело>
<тр>
(а)
общее содержание докозеновой кислоты в продуктах, указанных в Статье 1, с использованием метода, изложенного в Приложении VI к Регламенту (ЕЭС) № 1470/68; или
<тело>
<тр>
(b)
общее содержание цис-докозеновой кислоты в продуктах, указанных в Статье 1, методом, изложенным в Приложении VI к Регламенту (ЕЭС) № 1470/68, с использованием газожидкостной хроматографии в условиях, при которых цис-докозеновая кислота - и транс-изомеры докозеновых кислот разделены; подходящими для этой цели стационарными фазами являются, например, цианопропилполисилоксаны или жидкие кристаллы.
2. Если общее содержание:
<тело>
<тр>
(а)
докозеновые кислоты, определяемые согласно пункту 1 (а), или
<тело>
<тр>
(b)
цис-докозеновые кислоты, определяемые согласно пункту 1 (б),
продуктов, указанных в статье 1, в пересчете на общее содержание жирных кислот в жировом компоненте не превышает 5 %, дальнейшее определение не требуется. В противном случае содержание эруковой кислоты определяется методом, изложенным в Приложении к настоящему документу.
Статья 3
Государства-члены должны ввести в действие законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 1 февраля 1982 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЭРУКОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛАХ И ЖИРАХ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЧЕЛОВЕКОМ, А ТАКЖЕ В ЖИРОВОМ ИЛИ МАСЛЯНОМ КОМПОНЕНТЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, КОТОРЫЕ ДОБАВЛЯЛИ МАСЛА ИЛИ ЖИРЫ
И. ВВЕДЕНИЕ
1 ПОДГОТОВКА ПРОБ
1 Общие
Масса образца, подаваемого в лабораторию для анализа, обычно должна составлять 50 г, если не требуется большее количество.
1 Подготовка образца для анализа в лаборатории
Перед анализом образец должен быть гомогенизирован.
1 Контейнеры
Подготовленный таким образом образец следует хранить в воздухонепроницаемом и влагонепроницаемом контейнере.
2 РЕАГЕНТЫ
2 Вода
<тело>
<тр>
2.1.1.
Если вода требуется в качестве растворителя, разбавителя или для промывки, следует использовать дистиллированную или деминерализованную воду, по крайней мере, эквивалентной чистоты.
<тело>
<тр>
2.1.2.
Там, где упоминаются «раствор» или «разбавление» без указания какого-либо другого реагента, имеется в виду водный раствор или разбавление.
2.2. Химические вещества
Все используемые химикаты должны иметь признанное аналитическое качество, если не указано иное.
3 АППАРАТ
3.1. Список оборудования
Этот список содержит только элементы специального назначения и спецификации.
3.2. Аналитический баланс
«Аналитические весы» означают весы с чувствительностью 01 мг или выше.
4 ВЫРАЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Результаты
Результатом, указанным в официальном отчете об анализе, должно быть среднее значение, полученное не менее чем из двух определений, повторяемость которых является удовлетворительной.
4.2. Расчет процентов
Если не указано иное, результаты должны быть выражены в процентах (м/м) от общего количества жирных кислот в образце, полученном лабораторией.
4.3. Количество значащих цифр
Количество значащих цифр в выраженном таким образом результате должно определяться точностью метода.
II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭРУКОВОЙ КИСЛОТЫ
1. ОБЪЕМ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Метод определяет содержание эруковой кислоты:
<тело>
<тр>
(i)
масла и жиры, содержащие цетолевую кислоту (особый цис-изомер докозеновой кислоты, который содержится в рыбьем жире) и
<тело>
<тр>
(ii)
гидрогенизированные масла и жиры, содержащие транс- и цис-изомеры докозеновой кислоты.
2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Содержание эруковой кислоты: содержание эруковой кислоты, определенное указанным методом.
3 ПРИНЦИП
Метиловые эфиры жирных кислот, входящих в состав масла или жира, разделяют с помощью низкотемпературной тонкослойной хроматографии с аргентацией и количественно определяют с помощью газожидкостной хроматографии.
4 РЕАГЕНТЫ
<тело>
<тр>
4.1.
Диэтиловый эфир, не содержащий пероксида, свежеперегнанный.
<тело>
<тр>
4.2.
н-гексан.
<тело>
<тр>
4.3.
Силикагель G для тонкослойной хроматографии.
<тело>
<тр>
4.4.
Силикагель для колоночной хроматографии.
<тело>
<тр>
4.5.
Раствор нитрата серебра, 200 г/литр. 24 г нитрата серебра растворите в воде и доведите до 120 мл водой.
<тело>
<тр>
4.6.
Раствор метилэруката 5 мг/мл. Растворите 50 мг метилэруката в нескольких мл н-гексана и разбавьте до 10 мл н-гексаном.
<тело>
<тр>
4.7.
Метилтетракозаноат, раствор внутреннего стандарта, 0,25 мг/мл. Растворите 25 мг метилтетракозаноата в нескольких мл н-гексана (как 4,6) и разбавьте до 100 мл н-гексаном.
<тело>
<тр>
4.8.
Проявитель. Толуол: н-гексан 90:10 (по объему).
<тело>
<тр>
4.9.
2,7 Раствор дихлорфлуоресцеина 0,5 г/литр. Растворить при нагревании и перемешивании 50 мг 2,7-дихлорфлуоресцеина в 100 мл 50 %-ного водного метанола.
5. АППАРАТ
<тело>
<тр>
5.1.
Аппарат для тонкослойной хроматографии, включающий, в частности:
<тело>
<тр>
5.1.1.
Агрегат глубокой заморозки, способный поддерживать проявочную емкость и ее содержимое при температуре от минус 20 до минус 25 oC.
<тело>
<тр>
5.1.2.
Стеклянные пластины, 200 х 200 мм.
<тело>
<тр>
5.1.3.
Ультрафиолетовая лампа.
<тело>
<тр>
5.1.4.
Стеклянные колонки длиной около 200 мм, внутренним диаметром около 10 мм с фильтром из стекловаты или спеченного стекла. Альтернативно можно использовать небольшие воронки с фильтрами из спеченного стекла.
<тело>
<тр>
5.1.5.
Аппликатор для нанесения растворов в виде узкой полосы или полосы на пластины ТСХ.
<тело>
<тр>
5.2.
Газожидкостный хроматограф вместе с электронным интегратором, как описано в Разделе III Приложения VI к Регламенту Комиссии (ЕЭС) № 72/77.
6. ПРОЦЕДУРА
6.1. Получение метиловых эфиров жирных кислот
Возьмите около 400 мг масляного или жирового компонента образца для анализа и приготовьте раствор, содержащий от 20 до 50 мг/мл метиловых эфиров жирных кислот в н-гексане, по методу, описанному в разделе Раздел II.3 Приложения VI к Регламенту Комиссии (ЕЕС) № 72/77.
6.2. Тонкослойная хроматография
<тело>
<тр>
6.2.1.
Подготовка тарелок
Поместите 60 г силикагеля (4.3) в круглодонную колбу емкостью 500 мл, добавьте 120 мл раствора нитрата серебра (4.5) и встряхивайте в течение одной минуты до получения полностью однородной суспензии. Распределите суспензию обычным способом по тарелкам; толщина слоя должна составлять примерно 0,5 мм. Данного количества раствора достаточно для приготовления пяти пластин размером 200 х 200 мм.
Дайте пластинам частично высохнуть на воздухе (желательно оставив их в темноте примерно на 30 минут). Полностью высушите и активируйте пластины, поместив их в духовку при температуре 100 oC на два часа 30 минут. Используйте пластины как можно скорее после активации или аккуратно храните в темном шкафу, а затем повторно активируйте перед использованием. (Примечание: активация при 110 oC в течение одного часа может быть признана удовлетворительной, если в результате пластины не потемнеют). Перед использованием сделайте надрезы на покрытии на расстоянии 10 мм от боковых и верхней части каждой пластины, чтобы уменьшить краевые эффекты во время проявления.
<тело>
<тр>
6.2.2.
Применение метиловых эфиров
С помощью аппликатора (5.1.5) нанесите 50 мкл раствора метиловых эфиров (6.1), приготовленного из образца, узкой полоской длиной около 50 мм на расстоянии не менее 40 мм от стороны образца. пластину и 10 мм от дна. Применяют аналогичным образом 100 мкл раствора, содержащего равные объемы приготовленного раствора метиловых эфиров (6.1) и раствора метилэруката (4.6). Будьте особенно осторожны при нанесении растворов из-за хрупкости покрытия. (Примечание: при желании на планшет можно нанести 50 мкл раствора метилэруката (4.6), чтобы облегчить идентификацию полосы метилэруката после проявления: см. рисунок). После нанесения метиловых эфиров нижний край пластины выдерживают в диэтиловом эфире до тех пор, пока эфир не поднимется примерно на 5 мм над областью нанесения образца. При этом метиловые эфиры концентрируются в узкой полосе.
<тело>
<тр>
6.2.3.
Разработка тарелок
Налейте растворитель проявления (4.8) в резервуар на глубину около 5 мм и поместите резервуар вместе с крышкой в морозильную камеру (5.1.1) при температуре минус 25 oC или как можно ближе к этой температуре. (В некоторых случаях может оказаться полезным облицовать резервуар). Через два часа осторожно поместите пластинку в резервуар и дайте растворителю подняться примерно на половину-две трети высоты пластины. Снимите пластинку и осторожно выпарите из нее растворитель в токе азота. Установите пластину на место в резервуар и дайте растворителю подняться на верхнюю часть пластины. Снимите пластинку и, как ранее, высушите в токе азота, а затем осторожно опрыскайте раствором 2,7-дихлорфлуоресцеина (4.9).
Просмотрите пластинку в ультрафиолетовом свете и найдите полосу, содержащую метилэрукат в образце, по усиленной полосе в образце, к которому был добавлен метилэрукат (см. рисунок).
<тело>
<тр>
6.2.4.
Разделение фракций метилового эфира
Соскребите полосу метилэруката, полученную из образца, в стакан емкостью 50 мл, стараясь избежать потерь. Аналогично перенесите силикагель, расположенный выше и ниже полосы метилэруката, в другой стакан емкостью 50 мл. Эта полоса будет содержать все остальные фракции метиловых эфиров жирных кислот. В каждый химический стакан добавляют по 1,0 мл стандартного раствора метилтетракозаноата (4.7) и 10 мл диэтилового эфира (4.1). Перемешайте и перенесите содержимое стаканов в отдельные колонки или воронки (5.1.4), каждая из которых содержит около 1 г силикагеля (4.4); элюируйте метиловые эфиры тремя или четырьмя порциями диэтилового эфира по 10 мл. Соберите фильтраты в небольшие колбы. Выпарите каждый фильтрат до небольшого объема, используя слабый поток азота, и перенесите метиловые эфиры в небольшие стеклянные пробирки с заостренным дном. Удалите весь растворитель выпариванием в токе азота таким образом, чтобы метиловые эфиры концентрировались на дне пробирок. Растворите метиловые эфиры примерно в 25–50 мкл н-гексана (4.2).
6 Газожидкостная хроматография
<тело>
<тр>
6.3.1.
Выполните процедуру, описанную в разделе III Приложения VI к Регламенту Комиссии 72/77/EEC, и проанализируйте от 1 до 2 мкл растворов метилового эфира, полученных из (i) фракции, содержащей метилэрукат, и (ii) фракции, содержащие остаток метилированных жирных кислот.
<тело>
<тр>
6.3.2.
Получите от электронного интегратора следующие площади пиков:
<тело>
<тр>
(i)
из хроматограммы фракции, содержащей метилэрукат:
<тело>
<тр>
(а)
метилэрукат [E]
<тело>
<тр>
(b)
внутренний стандарт [L1]
<тело>
<тр>
(c)
общая площадь пиков метилового эфира, исключая внутренний стандарт [EF]
<тело>
<тр>
(ii)
из хроматограммы фракций, содержащих остаток метиловых эфиров жирных кислот
<тело>
<тр>
(а)
общая площадь пиков метилового эфира, исключая внутренний стандарт [RF]
<тело>
<тр>
(b)
внутренний стандарт [L2]
7. ВЫРАЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
7.1. Метод расчета и формула
<тело>
<тр>
7.1.1.
Содержание эруковой кислоты в образце, выраженное в виде ее метилового эфира в процентах от общего количества метиловых эфиров жирных кислот, полученных из образца, определяется по формуле:
где
E, EF, RF, L1 и L2 — это площади пиков, упомянутые в 6.3.2, исправленные при необходимости с использованием калибровочных коэффициентов.
Для практических целей значение метилэруката, заданное приведенной выше формулой, эквивалентно уровню эруковой кислоты, выраженному в процентах от общего уровня жирных кислот в образце.
<тело>
<тр>
7.1.2.
Если площади пиков получены в процентах, значения EF и RF можно рассчитать следующим образом:
<тело>
<тр>
EF
=
100 — L1
<тр>
РФ
=
100 — L2
<тело>
<тр>
7.1.3.
Метод расчета (7.1.1) предполагает, что уровень тетракозановой кислоты в пробе пренебрежимо мал. Если обнаружено присутствие значительных количеств этой кислоты, значение тетракозановой кислоты (L2), полученное из хроматограммы фракций, содержащих остаток метиловых эфиров жирных кислот, должно составлять уменьшено до:
<тело>
<тр>
L2
—
T2
где
<тело>
<тр>
T2
=
и
<тело>
<тр>
T2
=
площадь пика метилтетракозаноата, полученного из образца и составляющая часть площади пика, приписываемого внутреннему стандарту, на хроматограмме оставшейся фракции метиловых эфиров жирных кислот
<тр>
p2
=
Площадь пика метилпальмитата, полученная из хроматограммы оставшейся фракции
<тр>
T0
=
Площадь пика метилтетракозаноата, полученная из хроматограммы метиловых эфиров всех жирных кислот, определенной с помощью анализа, указанного в Статье 2 настоящей Директивы
<тр>
p0
=
Площадь пика метилпальмитата, полученная из хроматограммы метиловых эфиров общих жирных кислот, как определено анализом, указанным в Статье 2 настоящей Директивы.
