Десятая Директива Комиссии 84/425/EEC от 25 июля 1984 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов.

Десятая директива Комиссии

от 25 июля 1984 г.

установление методов анализа Сообщества для официального контроля кормов

(84/425/ЕЕС)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов [1], с последними поправками, внесенными Актом о присоединении Греции, и, в частности, Статьей 2 этого,

Принимая во внимание, что эта Директива требует, чтобы официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, предусмотренным положениями, установленными законом, постановлением или административными действиями, касающимися качества и состава кормов, проводился с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества;

Принимая во внимание, что Директивы Комиссии 71/250/EEC [2], 73/46/EEC [3], 74/203/EEC [4], 75/84/EEC [5], 76/372/EEC [6], как последние с поправками, внесенными Директивой 81/680/EEC [7], Директивами 71/393/EEC [8], 72/199/EEC [9], 78/633/EEC [10], с последними поправками, внесенными Директивой 84/4/EEC [11] и Директива 81/715/EEC [12] уже установили ряд методов анализа Сообщества; тогда как ход работы с тех пор делает целесообразным принять новый метод;

Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны требовать, чтобы анализы для официального контроля кормов в отношении содержания в них спирамицина проводились в соответствии с методом, описанным в Приложении.

Статья 2

Государства-члены должны ввести в силу законы, правила или административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 30 июня 1985 г. и немедленно проинформировать об этом Сообщество.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 25 июля 1984 года.

Для Комиссии

Пол Далсагер

Член Комиссии

[1] ОЖ № L 170, 3.8.1970, с. 2.

[2] ОЖ № L 155, 12.7.1971, с. 13.

[3] ОЖ № L 83, 30.3.1973, с. двадцать один.

[4] ОЖ № L 108, 22.4.1974, с. 7.

[5] ОЖ № L 32, 5. 2. 1975, с. 26.

[6] ОЖ № L 102, 15. 4. 1976, с. 8.

[7] ОЖ № L 246, 29.8.1981, с. 32.

[8] ОЖ № L 279, 20.12.1971, с. 7.

[9] ОЖ № L 123, 29.5.1972, с. 6.

[10] ОЖ № L 206, 29.7.1978, с. 43.

[11] ОЖ № L 15, 18. 1. 1984, с. 28.

[12] ОЖ № L 257, 10.9.1981, с. 38.

--------------------------------------------------

ПРИЛОЖЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПИРАМИЦИНА МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАРНОЙ СРЕДЕ

1. Цель и сфера применения

Метод предназначен для определения спирамицина в кормах и премиксах. Нижний предел определения — 1 мг/кг (1 ppm) [1].

2. Принцип

Пробу экстрагируют смесью метанол/фосфат-бикарбонатный буфер при pH 8. Экстракт декантируют или центрифугируют и разбавляют. Его антибиотическую активность определяют путем измерения диффузии спирамицина в агаризованной среде, инокулированной Micrococcus luteus. Диффузия проявляется образованием зон ингибирования микроорганизма. Диаметр этих зон принимают прямо пропорциональным логарифму концентрации антибиотика в диапазоне используемых концентраций антибиотика.

3. Микроорганизм: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553).

3.1. Поддержание культуры стека

Пробирки, содержащие откосы культуральной среды (4.1), инокулируют Micrococcus luteus и инкубируют в течение 24 часов при 30 o C. Хранят культуру в холодильнике при температуре около 4 o C. Повторно инокулируют каждые две недели.

3.2. Приготовление бактериальной суспензии [2]

Соберите ростки со свежеприготовленного агара (3.1) с 2–3 мл раствора хлорида натрия (4.3). Используйте эту суспензию для инокуляции 250 мл культуральной среды (4.1), содержащейся в колбе Ру, и инкубируйте в течение 18–20 часов при 30 °С. Соберите наросты в 25 мл раствора хлорида натрия (43) и перемешайте. Разбавляют суспензию в соотношении 1/10 раствором натрия хлорида (4.3). Светопропускание суспензии должно составлять около 75 %, измеренное при длине волны 650 нм в ячейке размером 1 см относительно раствора хлорида натрия (4.3). Эту суспензию можно хранить в течение одной недели при температуре около 4 oC.

4. Питательные среды и реагенты.

4.1. Культуральная среда [3]

Мясной пептон | 6,0 г |

Триптон | 4,0 г |

Дрожжевой экстракт | 3,0 г |

Мясной экстракт | 1,5 г |

Глюкоза | 1,0 г |

Агар | от 10,0 до 20,0 г |

Вода | 1000 мл |

pH от 6,5 до 6,6 (после стерилизации). | |

4.2. Аналитическая среда [3]

Триптон | 5,0 г |

Дрожжевой экстракт | 4,0 г |

Мясной экстракт | 3,0 г |

Агар | от 10,0 до 20,0 г |

Вода | 1000 мл |

pH 8,0 (после стерилизации). | |

4.3. Раствор хлорида натрия 0,8 % (мас./об.)

8 г натрия хлорида растворить в воде и довести до 1000 мл; стерилизовать.

4.4. Фосфатно-бикарбонатный буфер, pH 8,0

Дикалий гидрофосфат K2HPO4 | 16,7 г |

Калия дигидрофосфат KH2PO4 | 0,5 г |

Гидрокарбонат натрия NaHCO3 | 20,0 г |

Вода | 1000 мл |

4.5. Смесь метанол-фосфатно-бикарбонатного буфера (4.4)

50/50 (ж/б).

4.6 Стандартное вещество

Спирамицин известной активности (в МЕ).

5. Стандартные решения

Точную навеску стандартного вещества (4.6) растворяют в смеси (4.5) и разбавляют той же смесью, получая исходный раствор, содержащий 1000 МЕ спирамицина на миллилитр. При хранении в колбе с пробкой при температуре 4 o C этот раствор стабилен до пяти дней.

Из этого исходного раствора путем последовательного разбавления смесью (4.5) приготовьте следующие растворы:

С8 | 1 | МЕ/мл |

Сч | 0,5 | Ю/мл |

С2 | 0,25 | МЕ/мл |

С1 | 0,125 | МЕ/мл |

6. Приготовление экстракта и аналитических растворов

6.1. Добыча

Отвешивают навеску массой 20,0 г для кормов и от 1,0 до 20,0 г для премиксов. Добавьте 100 мл смеси (4,5) и взбалтывайте 30 минут. Центрифугируйте или декантируйте и разбавьте надосадочный раствор смесью (4.5) для получения ожидаемого содержания спирамицина 1 МЕ/мл (= мкг).

При ожидаемых уровнях спирамицина ниже 2,5 мг/кг корма экстракцию необходимо проводить следующим образом. Отвесьте пробу массой 20,0 г. Добавьте 100 мл смеси (4,5) и взбалтывайте 30 минут. Центрифугируйте несколько минут, отбирайте 50 мл надосадочного раствора и упаривайте примерно до 4 мл при пониженном давлении в ротационном испарителе при температуре не выше 40 оС. Разбавьте остаток смесью (4.5) до получения ожидаемого содержания спирамицина 1 МЕ/мл (= U8).

6.2. Аналитические решения

Из раствора U8 готовят растворы U4 (расчетное содержание: 0,5 МЕ/мл), U2 (расчетное содержание: 0,25 МЕ/мл) и U1 (расчетное содержание: 0,125 МЕ/мл) путем последовательного разведения (1 + 1). ) смесью (4.5).

7. Процедура анализа

7.1. Инокуляция аналитической среды

Инокулируют среду для анализа (4.2) бактериальной суспензией (3.2) при температуре около 50 oC. Предварительными испытаниями на чашках с аналитической средой (4.2) определяют количество бактериальной суспензии, необходимое для получения наиболее крупных и четких зон ингибирования при различных концентрациях спирамицина.

7.2. Подготовка тарелок

Диффузию через агар проводят в чашках с четырьмя концентрациями стандартного раствора (S8, S4, S2, S1) и четырьмя концентрациями анализируемого раствора (U8, U4, U2, U1). Эти четыре концентрации экстракта и стандарта обязательно должны быть помещены в каждую чашку. Для этого подбирают чашки достаточно большого размера, чтобы в агаровой среде можно было сделать не менее восьми отверстий диаметром от 10 до 13 мм и расстоянием между центрами не менее 30 мм. Испытание может проводиться на пластинах, состоящих из листа стекла с помещенным сверху алюминиевым или пластиковым кольцом диаметром 200 мм и высотой 20 мм.

Наливают в чашки некоторое количество среды (4.2), инокулированной, как указано в 7.1, так, чтобы получился слой толщиной около 2 мм (60 мл для чашки диаметром 200 мм). Дайте установить его ровно, просверлите отверстия и поместите в них точно отмеренные объемы аналитического и стандартного растворов (от 0,10 до 0,15 мл на отверстие, в зависимости от диаметра). Каждую концентрацию применяют не менее четырех раз, чтобы каждое определение подвергалось оценке 32 зон ингибирования.

7.3. Инкубация

Инкубируйте чашки в течение 16–18 часов при температуре 30 ± 2 oC.

8. Оценка

Измерьте диаметр зон торможения с точностью до 0,1 мм. Запишите средние значения для каждой концентрации на полулогарифмической миллиметровой бумаге, показывая логарифм концентраций по отношению к диаметрам зон ингибирования. Постройте линии наилучшего соответствия как стандартного решения, так и экстракта, например, как показано ниже.

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного высшего уровня (SH) по формуле:

(а) СЛ=7s1+4s2+s4-2s810

Определите точку «наилучшего соответствия» для стандартного нижнего уровня (SL) по формуле:

(б) Ш=7с8+4с4+с2-2с110

Аналогично рассчитайте точки «наилучшего соответствия» для самого низкого уровня экстракта (UL) и самого высокого уровня экстракта (UH), заменив u1, u2, u4 и u8 на s1, s2, s4 и s8 в приведенных выше формулах [4].

Запишите рассчитанные значения SL и SH на одной миллиметровой бумаге и соедините их, чтобы получить линию «наилучшего соответствия» стандартному раствору. Аналогично запишите UL и UH и соедините их, чтобы получить строку, наиболее подходящую для фрагмента.

При отсутствии каких-либо помех линии должны быть параллельны. Для практических целей линии можно считать параллельными, если значения (SH — SL) и (UH — UL) не отличаются более чем на 10 % от своего среднего значения.

Если окажется, что линии непараллельны, либо u1 и s1, либо u8 и s8 можно отбросить и рассчитать SL, SH, UL и UH с использованием альтернативных формул, чтобы получить альтернативные линии «наилучшего соответствия»:

(а') SL=5s1+2s2-s46 или 5s2+2s4-s86

(б') SH=5s4+2s2-s16 или 5s8+2s4-s26

и аналогично для UL и UH. Должны соблюдаться те же критерии параллелизма. Тот факт, что результат был рассчитан по трем уровням, должен быть отмечен в итоговом отчете.

Если линии считаются параллельными, вычислите логарифм относительной активности (log A) с помощью одной из следующих формул, в зависимости от того, три или четыре уровня использовались для оценки параллельности.

На четыре уровня

(в) журнал. А =u1+u2+u4+u8-s1-s2-s4-s8× 0,602u4+u8+s4+s8-u1-u2-s1-s2

На три уровня

(г) журнал. А =u1+u2+u4-s1-s2-s4× 0,401u4+s4-u1-s1

или

(г') журнал. А =u2+u4+u8-s2-s4-s8× 0,401u8+s8-u2-s2

Активность экстракта образца = активность соответствующего стандарта × A

(U8 = S8 × А)

Если обнаруживается, что относительная активность выходит за пределы диапазона от 0,5 до 2,0, повторите анализ, внося соответствующие корректировки в концентрации экстракта или, если это невозможно, в стандартные растворы. Если относительную активность невозможно привести в требуемый диапазон, любой полученный результат следует считать приблизительным, и это следует отметить в итоговом отчете.

Если линии считаются непараллельными, повторите определение. Если параллелизм все же не достигнут, определение следует считать неудовлетворительным.

Результат выразить в миллиграммах основания спирамицина на килограмм корма.

9. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, выполненных на одной и той же пробе одним и тем же аналитиком, не должна превышать:

- 2 мг/кг по абсолютной величине при содержании основания спирамицина до 10 мг/кг,

- 20 % относятся к самому высокому значению для содержания от 10 до 25 мг/кг,

- 5 мг/кг по абсолютной величине для содержания от 25 до 50 мг/кг,

- 10 % относятся к самому высокому значению для содержания выше 50 мг/кг.

[1] 1 мг основы спирамицина эквивалентен 3200 международным единицам (МЕ).

[2] Могут использоваться другие методы при условии, что установлено, что они дают аналогичные бактериальные суспензии.

[3] Можно использовать любую коммерческую питательную среду аналогичного состава, дающую те же результаты.

[4] Маленькие буквы «s» и «u» обозначают диаметры зон торможения.

--------------------------------------------------