Директива Комиссии 84/449/EEC от 25 апреля 1984 г., в шестой раз адаптирующаяся к техническому прогрессу. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ.

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ от 25 апреля 1984 г., в шестой раз адаптирующаяся к техническому прогрессу. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (84/449/EEC)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 67/548/ЕЕС от 27 июня 1967 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (1), с поправками, внесенными в шестой раз Директивой Совета 79/ 831/EEC (2) и, в частности, его статьи 19, 20 и 21,

Принимая во внимание, что статья 3 (1) Директивы 79/831/EEC предусматривает, что физико-химические свойства, токсичность и экотоксичность веществ и препаратов должны определяться в соответствии с методами, указанными в Приложении V;

Принимая во внимание, что статья 19 Директивы 79/831/EEC от 18 сентября 1979 г. предусматривает, что Приложение V подпадает под процедуру с участием Комитета по адаптации к техническому прогрессу; поскольку должное внимание следует уделять, в частности, любым методам, признанным и рекомендованным компетентными международными организациями;

Поскольку положения настоящей Директивы соответствуют мнению Комитета по адаптации к техническому прогрессу Директив по устранению технических барьеров в торговле опасными веществами и препаратами,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Текст Приложения V к Директиве 67/548/EEC настоящим заменяется текстом Приложения к настоящей Директиве.

Статья 2

Государства-члены должны принять и опубликовать до 1 июля 1985 г. меры, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, и немедленно проинформировать об этом Комиссию. Они должны применить эти меры не позднее 1 июля 1986 года.

Статья 3

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 25 апреля 1984 года.

Для Комиссии

Карл-Хайнц НАРЬЕС

Член Комиссии (1) ОЖ № L 196, 16.8.1967, с. 1. (2) ОЖ № L 259, 15.10.1979, с. 10.

ПРИЛОЖЕНИЕ

В Приложении изложены методы испытаний для определения физико-химических, токсикологических и экотоксикологических свойств, перечисленных в Приложениях VII и VIII к Директиве 79/831/ЕЕС. Методы основаны на методах, признанных и рекомендованных компетентными международными организациями (в частности, ОЭСР).

Когда такие методы были недоступны, применялись национальные стандарты или методы научного консенсуса. Как правило, испытания следует проводить с веществом в том виде, в котором оно продается. Следует обратить внимание на возможное влияние примесей на результаты испытаний.

Если методы настоящего Приложения не подходят для исследования определенного объекта, уведомитель должен обосновать используемый альтернативный метод.

Тесты и исследования на животных должны проводиться в соответствии с национальными правилами и с учетом гуманных принципов и международных достижений в области защиты животных.

Среди эквивалентных методов тестирования выбирают метод с использованием минимального количества животных.

СОДЕРЖАНИЕ

>ФАЙЛ ПИК="T0027346">

ЧАСТЬ А: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

А. 1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ/ДИАПАЗОН ПЛАВЛЕНИЯ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Описанные методы и устройства подлежат применению для определения температуры плавления химических веществ без ограничения степени их чистоты.

Выбор метода зависит от природы исследуемого вещества.

В результате ограничивающий фактор будет зависеть от того, можно ли вещество измельчить легко, с трудом или вообще нельзя измельчить.

Для некоторых веществ более целесообразным является определение точки замерзания или затвердевания, и стандарты для этих определений также включены в руководство.

1.2. Определения и единицы измерения

Точка плавления определяется как температура, при которой происходит фазовый переход из твердого состояния в жидкое при нормальном атмосферном давлении.

Эта температура идеально соответствует температуре точки затвердевания или точки замерзания.

Поскольку фазовый переход многих веществ происходит в широком диапазоне температур, его часто называют интервалом плавления.

Преобразование единиц (К в °С):

т = Т - 273,15

где t в °C, T в К.

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Это должно в первую очередь служить для периодической калибровки метода и для возможности сравнения результатов при применении другого метода.

Некоторые калибровочные вещества перечислены в ссылках (2).

1.4. Принцип метода испытаний

Определена температура (диапазон температур) фазового перехода из твердого состояния в жидкое. На практике при нагревании образца исследуемого вещества при атмосферном давлении определяют температуры начального плавления и конечной стадии плавления. Описаны три типа методов, а именно капиллярный метод, метод горячих стадий и определение точки замерзания. 1.4.1. Капиллярный метод 1.4.1.1. Устройства определения температуры плавления с жидкостной ванной

Небольшое количество тонкоизмельченного вещества загружают в капиллярную трубку и плотно упаковывают. Трубку нагревают вместе с термометром, и во время фактического плавления повышение температуры доводят до уровня менее примерно 1 К/мин. Определены начальная и конечная температуры плавления.

1.4.1.2. Металлический блок

Как описано в 1.4.1.1, за исключением того, что капиллярная трубка и термометр расположены в нагретом металлическом блоке и их можно наблюдать через отверстия в блоке.

1.4.1.3. Обнаружение фотоэлементов

Образец в капиллярной трубке автоматически нагревается в металлическом цилиндре. Луч света направляется через вещество через отверстие в цилиндре на точно калиброванный фотоэлемент. Оптические свойства большинства веществ изменяются от непрозрачных до прозрачных при плавлении. Интенсивность света, попадающего на фотоэлемент, увеличивается и посылает сигнал остановки на цифровой индикатор, считывающий температуру платинового термометра сопротивления, расположенного в термокамере. Этот метод не подходит для некоторых сильно окрашенных веществ.

1.4.2. Горячие этапы 1.4.2.1. Кофлер горячий бар

В горячем стержне Кофлера используются два куска металла с разной теплопроводностью, нагреваемые электрически, при этом стержень сконструирован таким образом, что градиент температуры по его длине практически линейный. Температура горячего стержня может находиться в диапазоне от 283 до 543 К с помощью специального устройства для измерения температуры, включающего бегун с указателем и язычок, предназначенный для конкретного стержня. Для определения температуры плавления вещество наносят тонким слоем непосредственно на поверхность горячего стержня. Через несколько секунд появляется резкая разделительная линия между жидкой и твердой фазой. Температура на разделительной линии считывается путем установки указателя на линию.

1.4.2.2. Расплавленный микроскоп

Для определения температуры плавления очень малых количеств материала используются несколько горячих столиков микроскопа. На большинстве горячих стадий температура измеряется чувствительной термопарой, но иногда также используются ртутные термометры. Типичный аппарат для определения температуры плавления с подогревом микроскопа имеет камеру нагрева, содержащую металлическую пластину, на которой на предметном стекле помещается образец. В центре металлической пластины имеется отверстие, через которое проникает свет от осветительного зеркала микроскопа. В процессе эксплуатации камера закрывается стеклянной пластиной, отсекающей доступ воздуха в рабочую зону.

Нагрев образца регулируется реостатом. Для очень точных измерений можно использовать поляризованный свет для оптически анизотропных веществ.

1.4.2.3. Метод мениска

Этот метод специально используется для полиамидов.

Определение температуры, при которой визуально наблюдается смещение мениска силиконового масла, заключенного между горячим столиком и покровным стеклом, поддерживаемым полиамидным испытуемым образцом.

1.4.3. Метод определения точки замерзания

Пробу помещают в специальную пробирку и помещают в аппарат для определения температуры кристаллизации. Во время охлаждения образец осторожно и непрерывно перемешивают, а температуру считывают и записывают с 30-секундными интервалами. Как только температура остается постоянной в течение нескольких показаний, эта температура (с поправкой на погрешность термометра) записывается как точка кристаллизации.

1,5. Критерии качества

Применимость и точность различных методов, используемых для определения температуры плавления/диапазона плавления, указаны в следующей таблице:

ТАБЛИЦА: ПРИМЕНИМОСТЬ МЕТОДОВ

А. Капиллярные методы

>ФАЙЛ ПИК="T0027347">

Б. Горячие стадии и методы замораживания

>ФАЙЛ ПИК="T0027348">

1.6. Описание методов

Процедуры почти всех методов испытаний описаны в международных и национальных стандартах (см. Приложение 1). 1.6.1. Методы с капиллярной трубкой

Мелко измельченные вещества обычно демонстрируют стадии плавления, показанные на рисунке 1, при медленном повышении температуры. >ФАЙЛ ПИК="T0027349">

При определении температуры плавления регистрируют температуры в начале плавления и на конечной стадии. 1.6.1.1. Устройства определения температуры плавления с аппаратом с жидкой ванной

На рисунке 2 показан тип стандартизированного прибора для измерения температуры плавления, изготовленного из стекла (JIS K 0064), все характеристики указаны в миллиметрах.

>PIC-ФАЙЛ="T0027350">

Жидкость для ванн:

Подходящую жидкость следует выбирать снизу в зависимости от температуры плавления. Парафин жидкий с температурой плавления не выше 473 К, концентрированная серная кислота или силиконовое масло с температурой плавления не выше 573 К.

При температуре плавления выше 523 К можно использовать смесь, состоящую из трех частей серной кислоты и двух частей сульфата калия (в массовом соотношении).

Термометр:

Следует использовать только те термометры, которые соответствуют требованиям следующих или эквивалентных стандартов: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Процедура:

Сухое вещество мелко измельчают в ступке и помещают в капиллярную трубку, сплавляя с одного конца так, чтобы после плотной упаковки уровень наполнения составлял примерно 3 мм. Для получения однородно упакованной пробы капиллярную трубку следует уронить с высоты примерно 700 мм через стеклянную трубку вертикально на часовое стекло.

Заполненные капилляры помещают в ванну так, чтобы средняя часть ртутной колбы термометра касалась капилляра в той части, где находится образец. Обычно капиллярную трубку вводят в аппарат примерно на 10 К ниже температуры плавления.

Жидкость в ванне нагревается так, что повышение температуры составляет примерно 3 К/мин. Жидкость необходимо размешать. При температуре примерно на 10 К ниже ожидаемой температуры плавления скорость повышения температуры доводят до максимума 1 К/мин.

Расчет:

Расчет температуры плавления следующий:

Т = ТД + 0,00016(ТД - ТЕ) n где:

T = скорректированная температура плавления в К.

TD = показание температуры термометра D в К.

TE = показание температуры термометра E в К.

n = количество делений ртутной нити на термометре D на выступающем стержне.

1.6.1.2. Металлический блок

Аппарат:

Он состоит из: - цилиндрического металлического блока, верхняя часть которого полая и образует камеру (см. рисунок 3),

- металлическая заглушка с двумя или более отверстиями, позволяющая монтировать трубки в металлический блок,

- система нагрева металлического блока, обеспечиваемая, например, электрическим сопротивлением, заключенным в блок,

- реостат для регулирования потребляемой мощности, если используется электрический нагрев,

- четыре окна из термостойкого стекла на боковых стенках камеры, расположенные диаметрально под прямым углом друг к другу. Перед одним из этих окон установлен окуляр для наблюдения за капиллярной трубкой. Остальные три окна используются для освещения внутренней части вольера с помощью ламп.

- капиллярная трубка из термостойкого стекла, закрытая с одного конца (см. 1.6.1.1).

Термометр:

См. стандарты 1.6.1.1.

Применимы также термоэлектрические приборы сопоставимой точности. >ФАЙЛ ПИК="T0027351">

Процедура:

См. 1.6.1.1. В этом случае нельзя применять поправку термометра. Зарегистрированная температура указывает точку плавления.

1.6.1.3. Обнаружение фотоэлементов

Аппарат и процедура:

Аппарат состоит из металлической камеры с автоматизированной системой нагрева. Три капиллярные трубки заполняются согласно 1.6.1.1 и помещаются в термостат.

Для калибровки устройства доступны пять линейных повышений температуры, а подходящее повышение температуры регулируется электрически с заранее выбранной постоянной и линейной скоростью. Регистраторы показывают фактическую температуру печи и температуру плавления вещества в капиллярах.

1.6.2. Горячие этапы 1.6.2.1. Кофлер горячий бар

Смотри Приложение.

1.6.2.2. Расплавленный микроскоп

Смотри Приложение.

1.6.2.3. Метод мениска (полиамиды)

Смотри Приложение.

Скорость нагрева до точки плавления должна быть менее 1 К/мин.

1.6.3. Методы определения температуры замерзания

Смотри Приложение.

2. ДАННЫЕ

В некоторых случаях необходима поправка термометра.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Должен быть указан использованный метод.

Заявленная температура плавления представляет собой среднее значение по крайней мере двух измерений, находящихся в диапазоне приблизительной точности (см. таблицу). Должна быть предоставлена ​​оценка точности. Если разница между температурой начала и конечной стадии плавления находится в пределах точности метода, за температуру плавления принимают температуру конечной стадии плавления, в противном случае указывают две температуры.

Некоторые вещества разлагаются или сублимируются до достижения точки плавления. В таких обстоятельствах об этом следует сообщить.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 102, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ИЮПАК, Физико-химические измерения: Каталог эталонных материалов национальных лабораторий, Чистая и прикладная химия, вып. 48, 1976, стр. 505–515.

Приложение Для получения дополнительных технических подробностей можно ознакомиться, например, со следующими стандартами:

1. Капиллярные методы >PIC FILE="T0027352">

2. Горячие этапы >PIC FILE="T0027353">

3. Методы определения точки замерзания >PIC FILE="T0027354">

>PIC-ФАЙЛ="T0027355">

А. 2. ТЕМПЕРАТУРА КИПЕНИЯ/ДИАПАЗОН КИПЕНИЯ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Описанные здесь методы и устройства можно применять к жидким веществам при условии, что они не вступают в химические реакции ниже температуры кипения (например: автоокисление, перегруппировка, разложение и т. д.). Методы могут применяться к чистым и нечистым жидким веществам.

Особое внимание уделяется методу с использованием фотоэлементной регистрации, поскольку этот метод позволяет определять как точки плавления, так и точки кипения. Кроме того, измерения могут выполняться автоматически.

«Динамический метод» имеет то преимущество, что его также можно применять для определения давления паров, и нет необходимости корректировать температуру кипения до нормального давления (101325 кПа), поскольку стандартное давление можно регулировать во время измерения. Но этот метод в настоящее время не автоматизирован.

Примечания

Влияние примесей на определение температуры кипения во многом зависит от природы примеси. Эффект может быть значительным, если в образце присутствует легколетучий растворитель.

Состав исследуемой пробы меняется от измерения к измерению из-за улетучивания низкокипящих компонентов: в этих обстоятельствах получаются постоянно возрастающие значения.

1.2. Определения и единицы измерения

Стандартная температура кипения описывается как температура, при которой давление насыщенного пара жидкости такое же, как стандартное давление.

Измеренная температура кипения зависит от атмосферного давления. Количественно эту зависимость можно описать уравнением Клаузиуса-Клапейрона следующим образом: >PIC FILE="T0027356">

где:

p = давление паров вещества в Паскалях >PIC FILE="T0027357">

R = универсальная молярная газовая постоянная = 8,31 Дж моль-1 К-1

(Температура Т выражается в К).

Температура кипения (температура кипения) указывается с учетом давления окружающей среды во время измерения.

Конверсии:

Давление (единицы измерения: кПа)

100 кПа = 1 бар = 0,1 МПа (единицы «бар» по-прежнему допустимы, но не рекомендуются);

133 Па = 1 мм рт. ст. = 1 Торр (единицы «мм рт. ст.» и «Торр» не допускаются).

Температура (единицы измерения: К)

т = Т - 273,15

(t в °C и T в К).

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Это должно в первую очередь служить для периодической калибровки метода и для сравнения результатов.

Некоторые калибровочные вещества можно найти в методах, перечисленных в Приложении.

1.4. Принцип метода испытаний

Все методы определения температуры кипения (диапазона кипения) основаны на измерении температуры кипения. Описаны пять методов. 1.4.1. Определение с помощью эбуллиометра

Эбуллиометры изначально были разработаны для определения молекулярной массы по повышению температуры кипения, но они также подходят для точного измерения температуры кипения. Очень простое устройство описано в ASTM D 1120-72 (см. Приложение). Жидкость в этом аппарате нагревают в равновесных условиях при атмосферном давлении до кипения.

1.4.2. Динамический метод

Этот метод включает измерение температуры повторной конденсации пара с помощью термопары в флегме во время кипения. В этом методе давление можно варьировать.

1.4.3. Метод дистилляции для определения температуры кипения и диапазона кипения.

Этот метод включает перегонку жидкости, измерение температуры переконденсации паров и определение количества дистиллята.

1.4.4. Метод по Сиволобову

Образец нагревается в пробирке, погруженной в жидкость на тепловой бане. В пробирку с образцом погружают расплавленный капилляр, содержащий в нижней части пузырь воздуха.

Определяют температуру, при которой из капилляра вырывается регулярная цепочка пузырьков, или температуру, при которой при мгновенном охлаждении цепочка пузырьков останавливается и жидкость внезапно начинает подниматься в капилляре (Сиволобов).

1.4.5. Обнаружение фотоэлементов

Следуя принципу Сиволобоффа, автоматические фотоэлектрические измерения производятся с использованием поднимающихся пузырьков.

1,5. Критерии качества

Применимость и точность различных методов, используемых для определения температуры/диапазона кипения, указаны в таблице 1.

1.6. Описание методов

Процедуры некоторых методов испытаний описаны в международных и национальных стандартах (см. Приложение). 1.6.1. Эбуллиометр

Смотри Приложение.

1.6.2. Динамический метод

См. метод испытаний А.4 для определения давления паров.

Регистрируют температуру кипения, наблюдаемую при приложенном давлении 101325 кПа.

1.6.3. Процесс дистилляции (диапазон кипения)

Смотри Приложение.

ТАБЛИЦА 1: СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ >PIC FILE="T0027358">

1.6.4. Метод по Сиволобову

Образец нагревается в приборе для измерения температуры плавления в трубке для образца диаметром около 5 мм (рисунок 1).

На рисунке 1 показан тип стандартизированного прибора для измерения температуры плавления и кипения (JIS K 0064) (из стекла, все характеристики указаны в миллиметрах).

>ФАЙЛ ПИК="T0027359">

В пробирку для пробы помещают капиллярную трубку (кипящий капилляр), вплавленную примерно на 1 см выше нижнего конца. Уровень добавления испытуемого вещества таков, что расплавленный участок капилляра находится ниже поверхности жидкости. Пробирка с кипящим капилляром крепится либо к термометру резинкой, либо фиксируется подставкой сбоку (см. рис. 2).

>ФАЙЛ ПИК="T0027360">

Жидкость для ванны выбирается в зависимости от температуры кипения. При температуре до 573 К можно использовать серную кислоту или силиконовое масло. Жидкий парафин можно использовать только при температуре до 473 К. Нагрев жидкости в ванне сначала следует отрегулировать так, чтобы повышение температуры составляло 3 К/мин. Жидкость для ванны необходимо перемешивать. При температуре примерно на 10 К ниже ожидаемой точки кипения нагрев снижается так, что скорость повышения температуры составляет менее 1 К/мин. При приближении к температуре кипения из кипящего капилляра начинают выходить пузырьки.

Точка кипения — это точка, когда при кратковременном охлаждении череда пузырьков прекращается и жидкость внезапно начинает подниматься по капилляру. Соответствующее показание термометра является температурой кипения вещества.

В модифицированном принципе (рисунок 3) температура кипения определяется в капилляре для определения температуры плавления. Его растягивают до тонкой точки длиной около 2 см (а) и всасывают небольшое количество образца. Открытый конец тонкого капилляра закрывается плавлением, так что на конце располагается небольшой пузырь воздуха. При нагревании в аппарате для определения температуры плавления (б) пузырек воздуха расширяется. Точка кипения соответствует температуре, при которой пробка вещества достигает уровня поверхности жидкости ванны (в).

1.6.5. Обнаружение фотоэлементов

Образец нагревается в капиллярной трубке внутри нагретого металлического блока.

Луч света направляется через соответствующие отверстия в блоке через вещество на точно калиброванный фотоэлемент.

При повышении температуры образца из кипящего капилляра выходят одиночные пузырьки воздуха. При достижении температуры кипения количество пузырьков значительно увеличивается. Это вызывает изменение интенсивности света, регистрируемое фотоэлементом, и подает сигнал остановки индикатору, считывающему температуру платинового термометра сопротивления, расположенного в блоке.

Этот метод особенно полезен, поскольку позволяет проводить определения при температуре ниже комнатной до 253,15 К (-20 °С) без каких-либо изменений в аппаратуре. Прибор необходимо просто поместить в холодную комнату или охлаждающую ванну. Точное выполнение определения точки кипения можно получить из руководства к прибору.

2. ДАННЫЕ

При небольших отклонениях от нормального давления (максимум ± 5 кПа) температуры кипения нормализуются на Tn с помощью следующего числового уравнения Сидни Янга: >PIC FILE= "T0027361">

где: >ФАЙЛ PIC= "T0027362">

p = измерение давления в кПа

fT = скорость изменения температуры кипения в зависимости от давления, К/кПа.

T = измеренная температура кипения в К

Tn = температура кипения, приведенная к нормальному давлению в К.

Температурно-поправочные коэффициенты fT и уравнения для их аппроксимации включены в упомянутые выше международные и национальные стандарты для многих веществ.

Например, в методе DIN 53171 упоминаются следующие приблизительные поправки на растворители, входящие в состав красок:

ТАБЛИЦА 2: ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПОПРАВКИ fT >PIC FILE="T0027363">

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Должен быть указан использованный метод. Заявленная температура кипения представляет собой среднее значение по крайней мере двух измерений, которые находятся в диапазоне приблизительной точности, указанном в таблице 1. Если определения невоспроизводимы, следует рассмотреть другие методы.

Должны быть указаны измеренные температуры кипения и их среднее значение, а давление(я), при которых проводились измерения, должно быть указано в кПа.

Давление предпочтительно должно быть близко к нормальному давлению. Если испытуемое вещество кипит в определенном диапазоне температур, этот диапазон должен быть указан. Для всех результатов должны быть предоставлены оценки точности.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 103, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

Приложение

Дополнительные технические подробности можно найти, например, в следующих стандартах: >PIC FILE="T0027469">

А. 3. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОТНОСТЬ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Описанные методы определения относительной плотности применимы к твердым и жидким веществам без каких-либо ограничений по степени их чистоты. Различные методы, которые следует использовать, перечислены в таблице 1.

1.2. Определения и единицы измерения

Относительная плотность (D420) твердых или жидких веществ представляет собой соотношение между массой объема исследуемого вещества, определенной при 20 °С, и массой того же объема воды, определенной при 4 °С. Относительная плотность не имеет размерности. >ФАЙЛ ПИК="T0027592">

Плотность указывается в единицах СИ, кг/м3.

1.3. Эталонные вещества (1) (2)

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества.

Они должны в первую очередь служить для периодической калибровки метода и обеспечения возможности сравнения результатов.

1.4. Принцип методов

Используются четыре метода. 1.4.1. Методы плавучести 1.4.1.1. Ареометр (для жидких веществ)

Достаточно точные и быстрые определения плотности можно получить с помощью поплавковых ареометров, которые позволяют определять плотность жидкости по глубине погружения по градуированной шкале.

1.4.1.2. Гидростатический баланс (для жидких и твердых веществ)

Разницу между весом испытуемого образца, измеренного на воздухе и в воде, можно использовать для определения его плотности.

Для твердых веществ измеренная плотность является репрезентативной только для конкретного используемого образца. Для определения плотности жидкостей тело известного объема v взвешивают сначала на воздухе, а затем в жидкости.

1.4.1.3. Метод погруженного шара (для жидких веществ) (3)

В этом методе плотность жидкости определяют по разнице результатов взвешивания жидкости до и после погружения шарика известного объема в исследуемую жидкость.

1.4.2. Пикнометрические методы

Для твердых веществ и жидкостей можно использовать пикнометры различной формы и известных объемов. Плотность рассчитывают по разнице веса полного и пустого пикнометра и его известного объема.

1.4.3. Пикнометр сравнения воздуха (для твердых веществ)

Плотность твердого тела в любой форме можно измерить при комнатной температуре с помощью пиконометра сравнения газов. Объем вещества измеряют на воздухе или в инертном газе в баллоне переменного калиброванного объема. Для расчета плотности проводится одно измерение массы после завершения измерения объема.

1.4.4. Осциллирующий плотномер (4) (5) (6)

Плотность жидкости можно измерить осциллирующим плотномером. Механический генератор, построенный в форме U-образной трубки, вибрирует с определенной частотой, которая зависит от массы генератора. Введение образца изменяет резонансную частоту генератора. Прибор необходимо калибровать по двум жидким веществам известной плотности.

Эти вещества предпочтительно следует выбирать таким образом, чтобы их плотности находились в измеряемом диапазоне.

1,5. Критерии качества

Применимость различных методов, используемых для определения относительной плотности, указана в таблице.

Точность, указанная в стандарте ISO, относится только к чистым веществам.

1.6. Описание методов

Стандарты, приведенные в качестве примеров, с которыми можно ознакомиться для получения дополнительных технических подробностей, приведены в Приложении.

Испытания должны проводиться при температуре 20 °C и проводиться как минимум два измерения.

2. ДАННЫЕ

См. стандарты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Необходимо указать использованный метод/стандарт.

Относительную плотность (D420) следует указывать, как определено в 1.2, вместе с физическим состоянием измеряемого вещества.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

ТАБЛИЦА: ПРИМЕНИМОСТЬ МЕТОДОВ >ФАЙЛ PIC="T0027364">

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 109, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ИЮПАК, Рекомендуемые эталонные материалы для реализации физико-химических свойств, Чистая и прикладная химия, том. 48, 1976, стр. 508.

(3) Вагенбрет, Х., Дайвинг-шар для определения плотности жидкостей, Технические измерения, т. 1, вып. 11, 1979, стр. 427–430.

(4) Леопольд Х. Цифровое измерение жидкостей // Электроника. 19, 1970, с. 297–302.

(5) Баумгартен Д., Контроль количества расфасованных продуктов. Методы определения плотности жидких продуктов и их практическое применение, Фармацевтическая промышленность, том. 37, 1975, стр. 717–726.

(6) Риман Дж. Использование цифрового измерения плотности в лаборатории пивоваренного завода. Brewing Science, vol. 9, 1976, стр. 253–255.

Приложение

Для получения дополнительных технических подробностей можно ознакомиться, например, со следующими стандартами: 1. Методы плавучести >PIC FILE="T0027365">

2. Пикнометрические методы >PIC FILE="T0027366">

>ФАЙЛ ПИК="T0027367">

3. Пикнометр для сравнения воздуха >PIC FILE="T0027368">

А. 4. ДАВЛЕНИЕ ПАРА

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Для проведения этого испытания полезно иметь предварительную информацию о структуре, температуре плавления и температуре кипения вещества.

Не существует единой процедуры измерения, применимой для всего диапазона давлений пара. Поэтому рекомендуется использовать несколько методов измерения давления пара от -3 до 105 Па.

Примеси обычно влияют на давление пара. Влияние примесей на определение давления пара во многом зависит от вида примеси. Эффект может быть значительным, если в образце присутствует легколетучий растворитель.

1.2. Определения и единицы измерения

Давление пара вещества определяется как давление насыщения над твердым или жидким веществом. При термодинамическом равновесии давление пара чистого вещества зависит только от температуры.

Единицей давления в системе СИ, которую следует использовать, является Паскаль (Ньютон/м2).

Исторически использовавшиеся единицы измерения вместе с их коэффициентами пересчета: >PIC FILE="T0027369">

Единицей температуры в системе СИ является градус Кельвина (К).

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечивать возможность сравнения результатов при применении другого метода.

1.4. Принцип методов испытаний

Для определения давления пара предложены пять методов, которые можно применять в различных диапазонах давления пара. Для каждого метода давление пара определяется при различных температурах. В ограниченном диапазоне температур логарифм давления пара чистого вещества является линейной функцией обратной температуры. 1.4.1. Динамический метод

При динамическом методе измеряется температура кипения, соответствующая заданному давлению.

Рекомендуемый диапазон:

От 103 до 105 Па, от 20 до 100 °C.

Этот метод также рекомендован для определения температуры кипения и пригоден для этой цели до 350 °C.

1.4.2. Статический метод

В статическом процессе, при термодинамическом равновесии, давление пара, установившееся в замкнутой системе, определяется при заданной температуре.

Этот метод пригоден для однокомпонентных и многокомпонентных твердых веществ и жидкостей.

Рекомендуемый диапазон:

От 10 до 105 7Па, от 0 до 100 °C.

1.4.3. изотенископ

Этот стандартизированный метод также является статическим, но обычно не подходит для многокомпонентных систем. Дополнительная информация доступна в методе ASTM D-2879-75.

Рекомендуемый диапазон:

от 100 до 105 Па в диапазоне от 0 до 100 °C.

1.4.4. Баланс давления пара

Количество вещества, покидающего ячейку в единицу времени через отверстие известного размера, определяют в условиях вакуума, при которых возврат вещества в ячейку пренебрежимо мал (например, путем измерения импульса, генерируемого на чувствительных весах струей пара, или путем измерения потеря веса).

Рекомендуемый диапазон:

От 10-3 до 1 Па, от 0 до 100 °C.

1.4.5. Метод газонасыщения

Поток инертного газа-носителя пропускается над веществом таким образом, что оно насыщается его парами, а затем пар собирается в подходящей ловушке. Измерение количества материала, переносимого известным количеством газа-носителя, используется для расчета давления пара при заданной температуре.

Рекомендуемый диапазон:

до 1 Па.

1,5. Критерии качества

Различные методы определения давления паров сравниваются по применению, повторяемости, воспроизводимости, диапазону измерения, существующему стандарту. Это сделано в следующей таблице.

ТАБЛИЦА: КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА >ФАЙЛ PIC="T0027370">

1.6. Описание методов 1.6.1. Динамическое измерение 1.6.1.1. Аппарат

Измерительный аппарат обычно состоит из кипящего сосуда с прикрепленным к нему охладителем из стекла или металла (рисунок 1), оборудования для регулирования и измерения температуры и оборудования для регулирования и измерения давления. Типовой измерительный прибор, показанный на рисунке, изготовлен из термостойкого стекла и состоит из пяти частей:

Большая труба с частично двойными стенками состоит из заземляющей рубашки, охладителя, охлаждающего сосуда и впускного отверстия.

Стеклянный цилиндр с насосом Коттрелла установлен в кипящем отделе трубки и имеет шероховатую поверхность из дробленого стекла во избежание «ударов» в процессе кипения.

Температура измеряется с помощью термопары или термометра сопротивления, погруженного в небольшое количество масла. Он вставляется в зарядную трубку, которая имеет заземляемый штуцер и герметизирована снизу.

Крестовина обеспечивает необходимые соединения с оборудованием регулирования и измерения давления.

Колба, выполняющая роль буферного объема, соединена с измерительным прибором посредством капиллярной трубки.

Для нагрева кипящего сосуда используется патронный нагреватель, вставленный в стеклянный аппарат снаружи снизу. Требуемый ток нагрева устанавливается с помощью трансформатора, регулирующего напряжение, и контролируется с помощью амперметра.

Масляный насос используется для установки желаемого вакуума от 102 Па до примерно 105 Па.

Баллон с азотом используется для установки желаемого давления и подключается через клапан, который также используется для вентиляции аппарата.

Для измерения давления используется прецизионный манометр, подсоединенный к крестовине.

1.6.1.2. Процедура измерения

Давление паров измеряется путем определения температуры кипения образца при различных заданных давлениях примерно от 103 до 105 Па. Устойчивая температура при постоянном давлении указывает на то, что точка кипения (равновесие кипения в случае смеси) достигнута. Пенящиеся вещества не могут быть измерены этим методом.

Для проведения измерения все стеклянные детали сначала тщательно очищаются и высушиваются, а затем вакуумируются под газовым балластом. Затем вещество вводится в аппарат. Если твердые вещества не находятся в порошкообразной форме, в процессе заполнения могут возникнуть проблемы, но их можно обойти, нагрев рубашку охлаждающей воды. После наполнения аппарат фланцуют и вещество дегазируют. Затем устанавливается самое низкое желаемое давление и включается система отопления. Одновременно к самописцу подключают термопару или термометр сопротивления. Равновесие достигается, когда можно определить постоянную температуру кипения при заданном постоянном давлении. После фиксации этой точки равновесия устанавливается более высокое давление. Процесс продолжается таким образом до тех пор, пока не будет достигнуто значение 105 Па (всего примерно от 5 до 10 точек измерения). В качестве проверки необходимо повторить точки равновесия при уменьшении давления.

1.6.2. Статическое измерение 1.6.2.1. Аппарат

Типовой измерительный аппарат (рисунок 2) включает систему нагрева и охлаждения, состоящую из стекла и металла, для доведения образца до регулируемой температуры, а также оборудование для установки и измерения давления и температуры.

Камера для проб имеет с одной стороны высоковакуумный клапан из нержавеющей стали, а с другой стороны U-образную трубку, содержащую подходящую манометрическую жидкость. Другой конец U-образной трубки соединен с крестовиной, одна ветвь которой ведет к вакуумному насосу, другая — к баллону с азотом, а третья — к манометру.

Для доведения вещества до регулируемой температуры всю камеру для проб, включая тарелку клапана и достаточно большую часть U-образной трубки (для практических целей до высоты тарелки клапана), помещают в ванну с соответствующей постоянной температурой. Температура измеряется с помощью термопары или термометра сопротивления очень близко к внешней стороне камеры для проб и может быть записана.

Для переохлаждения образца подходит жидкий азот или смесь сухого льда и спирта. Ультракриостат используется для измерений при низких температурах.

Для вакуумирования аппарата до необходимого давления используется подходящий насос.

Давление паров вещества обычно измеряют косвенно через нулевой индикатор. Этот нулевой индикатор может представлять собой U-образную трубку, содержащую жидкость, как указано ниже, или, среди прочего, мембранный манометр. В ванне с регулируемой температурой давление пара выводит жидкость в U-образной трубке из равновесия. Азот теперь подается в аппарат из подключенного баллона с азотом через клапан, чтобы компенсировать влияние давления паров и вернуть манометр обратно в ноль. Необходимое для этого давление азота считывается с помощью прецизионного манометра, который находится при температуре окружающей среды и соответствует давлению паров вещества при соответствующей устойчивой температуре. Различные жидкости, такие как ртуть, силиконовые масла, фталаты, в зависимости от диапазона давлений и химического поведения вещества, могут использоваться в качестве жидкостей U-образной трубки для балансировки нуля.

Ртуть можно использовать при атмосферном давлении до 102 Па, силиконовые масла и фталаты также при давлениях ниже 102 Па и до 10 Па; мембранный манометр можно применять даже при давлениях ниже 10-1 Па.

1.6.2.2. Процедура измерения

Перед измерением все части аппарата на рис. 2 тщательно очищаются растворителями, а затем сушатся в вакууме. Затем U-образную трубку наполняют желаемой жидкостью, которую перед заполнением следует дегазировать при повышенной температуре.

После заполнения веществом аппарат фланцуют и камеру для образца достаточно переохлаждают. Затем при открытом клапане над камерой для проб находящийся в ней воздух в течение нескольких минут откачивают из аппарата. Затем кран над веществом закрывают, пробу доводят до выбранной температуры, при этом наблюдают за результирующим смещением колонок и при необходимости компенсируют их до нулевого положения азотом до достижения постоянства температуры. Затем камера для проб снова переохлаждается. Если в переохлажденном состоянии наблюдается остаточное давление, то оно вызвано либо содержащимся в образце воздухом, который выделяется в процессе нагрева и может быть отведен, либо недостаточно низкой температурой охлаждения. В этом случае в качестве охлаждающей жидкости необходимо использовать жидкий азот.

После достаточной дегазации образца температурную зависимость давления пара определяют в достаточно малых температурных интервалах.

1.6.3. изотенископ

Полное описание этого метода можно найти в ссылке 2. Принцип действия измерительного устройства показан на рисунке 3. Подобно статическому методу, описанному в 1.6.2, изотенископ подходит для исследования твердых тел и жидкостей.

В случае жидкостей жидкостью во вспомогательном манометре служит само вещество. В случае твердых веществ в зависимости от диапазона давлений и температур применяют манометрические жидкости, перечисленные в 1.6.2. Для жидкостей сфера изотенископа заполняется исследуемым веществом, которое при кипении дегазируется при повышенной температуре.

Одновременно часть жидкости отгоняется из сферы, конденсируется в верхней охлаждаемой сфере и возвращается в U-образную трубку. Когда он достаточно заполнен дегазированной жидкостью, нижняя сфера с U-образной трубкой в ​​термостатируемой ванне доводится до выбранной температуры и результирующее давление пара измеряется косвенно, как и в методе, описанном в 1.6.2.

В случае твердых веществ дегазированная манометрическая жидкость заливается в выпуклость на длинном плече изотенископа. Затем исследуемое твердое вещество засыпают в нижнюю сферу и дегазируют при повышенной температуре. После этого изотенископ наклоняют так, чтобы манометрическая жидкость могла течь в U-образную трубку. Измерение давления пара в зависимости от температуры проводят по 1.6.2.

1.6.4. Баланс давления пара 1.6.4.1. Аппарат

В литературе имеется несколько различных конструкций (1). Описанный здесь пример иллюстрирует задействованные принципы. Ряд деталей показан на рисунке 4. Это опорная плита и колпак, насос с вакуумметром и аппаратура для измерения давления пара по отклонению указателя. На опорной плите смонтировано следующее встраиваемое оборудование: - Испарительная печь с фланцем и поворотным вводом. Печь-испаритель представляет собой плоский цилиндрический медный сосуд. (Печь также может быть изготовлена ​​из стекла и окружена медной стенкой.) Она установлена ​​в медном держателе, который привинчен к куску нержавеющей стали у нижнего выступающего края. Кусок нержавеющей стали, в свою очередь, крепится к опорной плите с помощью фланца так, чтобы его можно было вращать вокруг оси печи. Нагрев обеспечивается змеевиком нагревателя, который расположен внутри куска нержавеющей стали и, таким образом, закрыт от вакуумной камеры.

- Крышка печи изготовлена ​​из меди и имеет три испарительных отверстия различного сечения, расположенные под углом 90 градусов друг к другу. Вращая печь, желаемое отверстие печи или промежуточное положение можно поместить под прорезь в охладителе, расположенном эксцентрично по отношению к печи, таким образом направляя молекулярный луч на чашу весов или отклоняя его. Для измерения температуры в стенке печи монтируется термопара или термометр сопротивления.

- Весы представляют собой инструмент с подвижной катушкой. Указатель заменен небольшой трубкой, на которой закреплены балансир и противовес. Бревно имеет сменную чашу, изготовленную из тонкого куска позолоченного алюминия. Константановая проволока толщиной 0,1 мм, на которую можно установить калибровочные гири, прикреплена приблизительно к центру балансира. Давление пара можно зарегистрировать с помощью фотоэлектрического прибора нулевой точки.

- Цилиндрический латунный котел окружает чашу весов со всех сторон, за исключением двух прорезей для движения балансира и узкого отверстия для входа молекулярного луча. Отвод тепла наружу обеспечивается медной планкой наверху латунного котла, которая проходит через трубку из нержавеющей стали через опорную плиту и теплоизолируется от нее. Стержень погружают в колбу Дьюара, содержащую жидкий азот под пластиной основания.

1.6.4.2. Процедура измерения

Медная печь заполняется веществом, крышка закрывается, а пластинчатое отверстие, экран и охладитель скользят по печи. Колокол установлен, и вакуумные насосы включены. Конечное давление перед началом измерения составляет примерно 10-4 Па. С 10-2 Па и ниже начинается охлаждение холодильной камеры.

Через некоторое время весы достигнут достаточно низкой температуры, чтобы выходящая струя пара могла конденсироваться на чаше весов. Эта конденсация создает сигнал на подключенном рекордере. Этот сигнал можно использовать двумя способами: для конкретного аппарата, описанного здесь, давление пара определяется непосредственно по давлению на чаше весов (молекулярная масса не требуется). В то же время определяют конденсированную массу и, следовательно, можно рассчитать скорость испарения по времени осаждения. Последнее относится к более общим аппаратам. Затем давление пара можно также рассчитать на основе скорости испарения и молекулярной массы, используя соотношение Герца: >PIC FILE= "T0027371">

где:

G = скорость испарения (кг/с м2)

M = молярная масса (г/моль)

Т = температура (К)

R = универсальная молярная газовая постоянная (Дж/моль К)

p = давление пара (Па)

После достижения необходимого вакуума серия измерений начинается при самой низкой желаемой температуре измерения. Необходимое отверстие открывается, и струя пара проходит через экран, установленный непосредственно над крышкой, а затем попадает на охлаждаемую чашу весов. Размер чаши весов рассчитан таким образом, чтобы вся струя собиралась в косинусальном распределении. Импульс струи пара оказывает воздействие на поддон весов, где на его охлажденной поверхности происходит конденсация. Силой струи пара балка окалины будет отклоняться от равновесного состояния. На конце шкалы находится небольшая пластинка, которая регистрируется оптически с помощью призменной системы и двух фотодиодов. Подключенная схема управления затем мгновенно регулирует и сбрасывает весовую балку в сбалансированное состояние. Требуемый крутящий момент фиксируется и после уравновешивания соответствует давлению паров вещества.

Для дальнейших измерений температуру повышают небольшими интервалами до достижения максимального желаемого значения температуры. Затем образец снова охлаждают и можно записать вторую кривую давления пара. Две серии будут воспроизводимы только в том случае, если измеряемый образец достаточно чистый. Если третий прогон не подтвердил результаты второго прогона, то возможно, что вещество разлагается в измеряемом диапазоне температур.

1.6.5. Метод газонасыщения 1.6.5.1. Аппарат

Типичное устройство, используемое для проведения этого испытания, состоит из ряда компонентов, представленных на рисунке 5 и описанных ниже (1).

Инертный газ:

Газ-носитель не должен вступать в химическую реакцию с испытуемым веществом. Для этой цели обычно достаточно азота, но иногда могут потребоваться и другие газы. Используемый газ должен быть сухим (см. рисунок 5, позиция 4: датчик относительной влажности).

Управление потоком:

Для обеспечения постоянного и заданного потока через колонну сатуратора необходима соответствующая система газового контроля.

Уловители для сбора пара:

Они зависят от конкретных характеристик пробы и выбранного метода анализа. Пар должен улавливаться количественно и в такой форме, которая позволяет проводить последующий анализ. Для некоторых тестируемых веществ подходят ловушки, содержащие жидкости, такие как гексан или этиленгликоль. Для других могут быть применимы твердые поглотители.

Теплообменник:

Для измерений при различных температурах может потребоваться включение в комплект теплообменника.

Колонна сатуратора:

Тестируемое вещество представляет собой раствор, нанесенный на подходящую инертную основу. Носитель с покрытием упаковывают в колонну-сатуратор, размеры которой и скорость потока должны быть такими, чтобы обеспечить полное насыщение газа-носителя. Колонна сатуратора должна быть термостатирована. При измерениях при температуре выше 20 °С область между колонной насыщения и ловушками должна быть нагрета, чтобы предотвратить конденсацию испытуемого вещества.

1.6.5.2. Процедура измерения

Подготовка колонны-сатуратора:

К подходящему количеству носителя добавляют раствор испытуемого вещества в легколетучем растворителе. Следует добавить достаточное количество тестируемого вещества для поддержания насыщения на протяжении всего испытания. Растворитель полностью испаряется на воздухе или в ротационном испарителе, а тщательно перемешанный материал добавляется в сатураторную колонну. После термостатирования образца через аппарат пропускают сухой азот.

Измерение:

Уловители подключаются к линии вывода жидкости из колонки, и время регистрируется. Скорость потока проверяют в начале и через регулярные промежутки времени в ходе эксперимента с помощью пузырькового расходомера (или постоянно с помощью массового расходомера).

Необходимо измерить давление на выходе из сатуратора. Это можно сделать либо: (а) путем установки манометра между сатуратором и ловушками (из-за увеличения мертвого пространства и адсорбционной поверхности); или

(b) путем определения падения давления в конкретной системе улавливания, используемой в качестве функции скорости потока в отдельном эксперименте (может быть не очень удовлетворительным для жидкостных ловушек).

Время, необходимое для сбора количества тестируемого вещества, необходимого для различных методов анализа, определяется предварительным или расчетным путем. Перед расчетом давления пара при заданной температуре необходимо провести предварительные прогоны для определения максимальной скорости потока, при которой газ-носитель полностью насытится парами вещества. Это гарантируется, если газ-носитель проходит через сатуратор достаточно медленно, так что более низкая скорость не приводит к увеличению расчетного давления пара.

Конкретный аналитический метод будет определяться природой испытуемого вещества (например, газовая хроматография или гравиметрия).

Определяется количество вещества, переносимое известным объемом газа-носителя.

1.6.5.3. Расчет давления пара

Давление пара рассчитывается на основе плотности пара W/V по уравнению: >PIC FILE="T0027372">

где:

p = давление пара (Па)

W = масса адсорбированного испытуемого вещества (г)

V = объем насыщенного газа (м3)

R = универсальная молярная газовая постоянная (Дж/моль К)

Т = температура (К)

M = молярная масса (г/моль)

Измеренные объемы необходимо корректировать с учетом разницы давления и температуры между расходомером и термостатируемым сатуратором. Если расходомер расположен после пароуловителя, могут потребоваться поправки для учета любых испаряющихся ингредиентов ловушки (1).

2. ДАННЫЕ

Давление пара любым из предыдущих методов следует определять как минимум для двух температур. Предпочтительны три или более в диапазоне от 0 до 50 °C, чтобы проверить линейность кривой давления пара.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

В отчет по возможности должна быть включена следующая информация:

Точная характеристика вещества (идентификатор и примеси): - Не менее двух значений давления пара и температуры, предпочтительно в диапазоне от 0 до 50 °C. Он также должен включать все необработанные данные и логарифмическую кривую зависимости p от 1/T. Кроме того, следует дать оценку давления пара при температуре 20 или 25 °C.

Если наблюдается переход (изменение состояния, разложение), следует отметить следующую информацию: - характер изменения,

- температура, при которой происходит изменение атмосферного давления,

- давление паров на 10 и 20 °С ниже температуры перехода и на 10 и 20 °С выше этой температуры (за исключением случаев, когда происходит переход из твердого состояния в газ).

Вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, должны быть представлены.

Должен быть указан использованный метод.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 104, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 104, ссылка 4, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027373">

>ФАЙЛ ПИК="T0027374">

>ФАЙЛ ПИК="T0027375">

>ФАЙЛ ПИК="T0027376">

А. 5. ПОВЕРХНОСТНОЕ НАТЯЖЕНИЕ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Описанные методы подлежат применению для измерения поверхностного натяжения водных растворов.

Перед проведением этих испытаний полезно иметь предварительную информацию о растворимости в воде, строении, гидролизных свойствах и критической концентрации мицеллообразования вещества.

Следующие методы применимы к большинству химических веществ без каких-либо ограничений по степени их чистоты.

Измерение поверхностного натяжения методом кольцевого тензиометра ограничивается водными растворами с динамической вязкостью менее примерно 200 мПа·с.

1.2. Определения и единицы измерения

Энтальпия свободной поверхности на единицу площади поверхности называется поверхностным натяжением.

Поверхностное натяжение определяется как:

Н/м (единица СИ) или

мН/м (единица СИ)

1 Н/м = 103 дин/см

1 мН/м = дин/см в устаревшей системе СГС

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Это должно в первую очередь служить для периодической калибровки метода и давать возможность сравнивать результаты при применении другого метода.

Эталонные вещества, охватывающие широкий диапазон поверхностного натяжения, приведены в ссылках 1 и 2.

1.4. Принцип методов

Методы основаны на измерении максимальной силы, которую необходимо приложить вертикально к стремени или кольцу, контактирующему с поверхностью исследуемой жидкости, помещенной в мерный стакан, с целью отделения ее от этой поверхности. или на тарелке так, чтобы край контактировал с поверхностью, чтобы вытянуть образовавшуюся пленку.

1,5. Критерии качества

Эти методы обеспечивают большую точность, чем это может потребоваться для экологической оценки.

1.6. Описание методов 1.6.1. Пластинчатый метод

См. ISO-304 (Поверхностно-активные вещества – определение поверхностного натяжения путем нанесения жидких пленок).

1.6.2. Метод стремени

См. ISO 304 (Поверхностно-активные вещества. Определение поверхностного натяжения путем нанесения жидких пленок).

1.6.3. Кольцевой метод

См. ISO 304 (Поверхностно-активные вещества. Определение поверхностного натяжения путем нанесения жидких пленок).

1.6.4. Гармонизированный кольцевой метод ОЭСР 1.6.4.1. Аппарат

Для этого измерения подходят имеющиеся в продаже тензиометры. Они состоят из следующих элементов: - мобильный стол для проб,

- система измерения силы,

- измерительный корпус (кольцо),

- измерительный сосуд.

1.6.4.1.1. Мобильный стол для образцов

Передвижной стол для проб используется в качестве опоры для измерительного сосуда с регулируемой температурой, содержащего тестируемую жидкость. Вместе с силоизмерительной системой он установлен на стойке.

1.6.4.1.2. Система измерения силы

Система измерения силы (см. рисунок 1) расположена над столом для образцов. Погрешность измерения силы не должна превышать ± 10-6 Н, что соответствует пределу погрешности ± 0,1 мг при измерении массы. В большинстве случаев измерительная шкала имеющихся в продаже тензиометров откалибрована в мН/м, так что поверхностное натяжение можно считывать непосредственно в мН/м с точностью 0,1 мН/м.

1.6.4.1.3. Измерительный корпус (кольцо)

Кольцо обычно изготавливается из платино-иридиевой проволоки толщиной около 0,4 мм и средней окружностью 60 мм. Проволочное кольцо подвешивается горизонтально на металлическом штыре и кронштейне для крепления провода для обеспечения соединения с системой измерения силы (см. рисунок).

>ФАЙЛ ПИК="T0027377">

1.6.4.1.4. Измерительный сосуд

Измерительный сосуд, содержащий измеряемый испытуемый раствор, должен представлять собой стеклянный сосуд с контролируемой температурой. Он должен быть сконструирован таким образом, чтобы во время измерения температура жидкого испытуемого раствора и газовой фазы над его поверхностью оставалась постоянной и чтобы образец не мог испаряться. Допускаются цилиндрические стеклянные сосуды с внутренним диаметром не менее 45 мм.

1.6.4.2. Подготовка снаряда 1.6.4.2.1. Очистка

Стеклянные сосуды следует тщательно мыть. При необходимости их промывают горячей хромосерной кислотой, а затем сиропообразной фосфорной кислотой (от 83 до 98% по массе H3PO4), тщательно промывают водопроводной водой и, наконец, промывают бидистиллированной водой до получения нейтральной реакции и затем высушены или промыты частью измеряемой жидкости.

Кольцо сначала тщательно промывают в воде для удаления любых веществ, растворимых в воде, ненадолго погружают в хромосерную кислоту, промывают бидистиллированной водой до достижения нейтральной реакции и, наконец, ненадолго нагревают над пламенем метанола.

Примечание:

Загрязнения веществами, которые не растворяются и не разрушаются хромосерной или фосфорной кислотой, например силиконами, должны быть удалены с помощью подходящего органического растворителя.

1.6.4.2.2. Калибровка аппарата

Поверка прибора заключается в проверке нулевой точки и ее настройке так, чтобы показания прибора позволяли достоверно определять значения в мН/м.

Монтаж:

Аппарат необходимо выровнять, например, с помощью спиртового уровня на основании тензиометра, регулируя регулировочные винты в основании.

Регулировка нулевой точки:

После установки кольца на аппарат и перед погружением в жидкость показания тензиометра устанавливают на ноль и проверяют параллельность кольца поверхности жидкости. Для этой цели поверхность жидкости можно использовать как зеркало.

Калибровки:

Фактическую тестовую калибровку можно выполнить с помощью одной из двух процедур: >PIC FILE="T0027378">

1.6.4.3. Подготовка образцов

Водные растворы испытуемых веществ должны быть приготовлены в необходимых концентрациях в воде и не должны содержать нерастворенных веществ.

Раствор необходимо поддерживать при постоянной температуре (± 0,5 °C). Поскольку поверхностное натяжение раствора в измерительном сосуде меняется с течением времени, необходимо провести несколько измерений в разное время и построить кривую, показывающую зависимость поверхностного натяжения от времени. Когда дальнейших изменений не происходит, достигается состояние равновесия.

Пыль и газообразные загрязнения другими веществами мешают измерению. Поэтому работы следует проводить под защитным кожухом.

1.6.5. Условия испытаний

Измерение должно проводиться при температуре примерно 20°С и контролироваться с точностью ±0,5°С.

1.6.6. Выполнение теста

Измеряемые растворы фиксируют в тщательно очищенном мерном сосуде, стараясь избегать вспенивания, а затем мерный сосуд помещают на стол испытательного аппарата. Столешницу с мерным сосудом следует поднимать до тех пор, пока кольцо не погрузится под поверхность измеряемого раствора. Затем столешницу следует постепенно и равномерно опускать (со скоростью примерно 0,5 см/мин), чтобы отделить кольцо от поверхности до достижения максимального усилия. Слой жидкости, прикрепленный к кольцу, не должен отделяться от кольца. После завершения измерений кольцо снова погружают под поверхность и повторяют измерения до достижения постоянного значения поверхностного натяжения. Время от перекачивания раствора в измерительный сосуд фиксируют для каждого определения. Показания следует снимать при максимальной силе, необходимой для отрыва кольца от поверхности жидкости.

2. ДАННЫЕ >ФАЙЛ PIC="T0027379">

Харкинс и Джордан (3) эмпирически определили поправочные коэффициенты для значений поверхностного натяжения, измеренных методом колец, которые зависят от размеров кольца, плотности жидкости и ее поверхностного натяжения.

Поскольку определение поправочного коэффициента для каждого отдельного измерения по таблицам Харкинса и Джордана затруднительно, для расчета поверхностного натяжения водных растворов можно использовать упрощенную процедуру считывания скорректированных значений поверхностного натяжения непосредственно из таблицы. (Для показаний в диапазоне между табличными значениями должна использоваться интерполяция.) ТАБЛИЦА: КОРРЕКЦИЯ ИЗМЕРЕННОГО ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ >PIC FILE="T0027380">

где:

F = сила, измеренная на динамометре в месте разрыва пленки.

R = радиус кольца

f = поправочный коэффициент (1)

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет об испытаниях должен, по возможности, содержать как минимум следующую информацию: - использованный метод: метод кольцевого тензиометра, согласованный с ISO или ОЭСР;

- тип используемой воды или раствора,

- точная спецификация вещества (идентичность и примеси),

- результаты измерений: поверхностное натяжение (показания) с указанием как отдельных показаний, так и их среднего арифметического, а также скорректированного среднего значения (с учетом коэффициента оснащения и таблицы поправок),

- концентрация раствора,

- температура испытания,

- возраст использованного раствора; в частности время между приготовлением и измерением раствора,

- описание зависимости поверхностного натяжения от времени после переноса раствора в мерную емкость,

- должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей и физического состояния вещества.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 115, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) Чистая и прикладная химия, вып. 48, 1976, с. 511.

(3) Харкинс, В.Д., Джордан, Х.Ф., Дж. Амер. хим. Соц., вып. 52, 1930, с. 1751.

А.6. РАСТВОРИМОСТЬ В ВОДЕ

1. МЕТОД

Описанные методы основаны на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Для проведения этого теста полезно иметь предварительную информацию о структурной формуле, давлении паров, константе диссоциации и гидролизе (в зависимости от pH) вещества.

Не существует единого метода, охватывающего весь диапазон растворимости в воде.

Метод неприменим к летучим веществам.

Два метода испытаний, описанные ниже, охватывают весь диапазон растворимости: - один, который применяется к практически чистым веществам с низкой растворимостью (-2 грамма на литр) и стабильным в воде, называемый «методом колоночного элюирования»,

- другой, который применяется к практически чистым веществам с более высокой растворимостью (> 10-2 граммов на литр) и стабильным в воде, называемый «методом колбы».

На растворимость испытуемого вещества в воде может существенно влиять наличие примесей.

1.2. Определение и единицы измерения

Растворимость вещества в воде определяется массовой концентрацией насыщения вещества в воде при данной температуре. Растворимость в воде указывается в единицах массы на объем раствора. Единица измерения СИ — кг/м3 (также можно использовать граммы на литр).

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечивать возможность сравнения результатов при применении другого метода.

1.4. Принцип метода испытаний

Приблизительное количество пробы и время, необходимое для достижения массовой концентрации насыщения, следует определить с помощью простого предварительного испытания. 1.4.1. Колоночный метод элюирования

Этот метод основан на элюировании испытуемого вещества водой из микроколонки, наполненной инертным материалом-носителем, например стеклянными шариками, силикагелем или песком, и избытком испытуемого вещества. Растворимость в воде определяют при постоянной массовой концентрации элюата. Об этом свидетельствует плато концентрации как функция времени.

1.4.2. Колбовой метод

В этом методе вещество (твердые вещества необходимо измельчить) растворяют в воде при температуре несколько выше температуры испытания. После достижения насыщения смесь охлаждают и выдерживают при температуре испытания, перемешивая столько времени, сколько необходимо для достижения равновесия (2). Затем подходящим аналитическим методом определяют массовую концентрацию вещества в водном растворе, который не должен содержать нерастворенных частиц.

1,5. Критерии качества 1.5.1. Повторяемость

Для метода элюирования с колонки: 1.5.2. Чувствительность

Это зависит от метода анализа, но можно определить массовую концентрацию по меньшей мере до 10-6 граммов на литр.

1.6. Описание метода 1.6.1. Условия испытаний

Испытание предпочтительно проводить при температуре 20 ± 0,5 °C. Если есть подозрение на температурную зависимость растворимости (> 3 % на °C), следует также использовать две другие температуры, по крайней мере на 10 °C выше и ниже первоначально выбранной температуры. При этом регулировка температуры должна составлять ±0,1°С. Выбранная температура должна поддерживаться постоянной во всех соответствующих частях оборудования.

1.6.2. Предварительный тест

Примерно к 0,1 г образца (твердые вещества необходимо измельчить) в градуированном цилиндре емкостью 10 мл со стеклянной пробкой добавляют возрастающие объемы дистиллированной воды комнатной температуры в соответствии с шагами, указанными в таблице ниже: >PIC FILE= " Т0027381">

После каждого добавления указанного количества воды смесь энергично встряхивают в течение 10 мин и визуально проверяют на наличие нерастворенных частей пробы. Если после добавления 10 мл воды проба или ее части остаются нерастворенными, содержимое мерного цилиндра переносят в мерный цилиндр емкостью 100 мл, который затем дополняют водой до 100 мл и встряхивают. При более низкой растворимости время, необходимое для растворения вещества, может быть значительно больше (должно быть допущено 24 часа). Примерная растворимость приведена в таблице при том объеме добавленной воды, в котором происходит полное растворение пробы. Если вещество по-прежнему очевидно нерастворимо, следует провести дальнейшее разбавление, чтобы определить, следует ли использовать метод элюирования на колонке или метод растворимости в колбе.

1.6.3. Колоночный метод элюирования 1.6.3.1. Вспомогательный материал, растворитель и элюент

Материал носителя для метода элюирования на колонке должен быть инертным. Возможными материалами, которые можно использовать, являются стеклянные шарики и диоксид кремния. Для нанесения испытуемого вещества на материал носителя следует использовать подходящий летучий растворитель качества аналитического реагента. В качестве элюента или растворителя следует использовать бидистиллированную воду из стеклянных или кварцевых приборов.

Примечание

Нельзя использовать воду непосредственно из органического ионообменника.

1.6.3.2. Загрузка опоры

Приблизительно 600 мг материала носителя взвешивают и переносят в круглодонную колбу емкостью 50 мл.

Подходящее взвешенное количество тестируемого вещества растворяют в выбранном растворителе. К материалу подложки добавляют соответствующее количество раствора тестируемого вещества. Растворитель должен быть полностью выпарен, напр. в ротационном испарителе; в противном случае водонасыщение носителя не достигается из-за эффектов разделения на поверхности материала носителя.

Загрузка материала подложки может вызвать проблемы (ошибочные результаты), если тестируемое вещество осаждается в виде масла или другой кристаллической фазы. Проблему следует исследовать экспериментально.

Загруженному материалу носителя дают пропитаться примерно два часа примерно в 5 мл воды, а затем суспензию добавляют в микроколонку. Альтернативно, сухой загруженный материал носителя можно залить в микроколонку, заполненную водой, а затем уравновесить ее в течение примерно двух часов.

Тестовая процедура

Элюирование вещества из материала носителя может осуществляться одним из двух различных способов: - циркуляционным насосом (см. рисунок 1),

- уравнительный сосуд (см. рисунок 4).

1.6.3.3. Колоночный метод элюирования с рециркуляционным насосом

Аппарат

Схематическое устройство типичной системы представлено на рисунке 1. Подходящая микроколонка показана на рисунке 2, хотя допускается любой размер, при условии, что он соответствует критериям воспроизводимости и чувствительности. Колонка должна обеспечивать свободное пространство не менее пяти объемов слоя воды плюс не менее пяти проб. Альтернативно, размер можно уменьшить, если использовать подпиточный растворитель для замены первоначальных пяти объемов слоя, удаленных примесями.

Колонку следует подсоединить к циркуляционному насосу, способному контролировать поток примерно 25 мл/час. Насос подключается с помощью соединений из политетрафторэтилена и/или стекла. Колонка и насос в сборе должны иметь приспособления для отбора проб эффлюента и уравновешивания свободного пространства при атмосферном давлении. Материал колонки поддерживается небольшой (5 мм) пробкой из стекловаты, которая также служит для фильтрации частиц. Рециркуляционным насосом может быть, например, перистальтический насос (необходимо следить за тем, чтобы не происходило загрязнения и/или адсорбции материала трубки) или мембранный насос.

Процедура измерения

Начинается поток через колонну. Рекомендуется использовать скорость потока примерно 25 мл/час (приблизительно 10 объемов слоя/час для описанной колонки). Первые пять объемов слоя (минимум) отбрасывают для удаления водорастворимых примесей. После этого рециркуляционному насосу дают поработать до тех пор, пока не установится равновесие, определенное случайным образом по пяти последовательным пробам, концентрации которых не различаются более чем на ± 30 %. Эти пробы должны быть отделены друг от друга промежутками времени, соответствующими прохождению не менее 10 объемов слоя элюента.

1.6.3.4. Метод элюирования на колонке с уравнительным сосудом

Аппарат (см. рисунки 4 и 3)

Уравнительный резервуар: Соединение с уравнительным резервуаром осуществляется с помощью притертого стеклянного соединения, соединенного трубкой из ПТФЭ. Рекомендуется использовать скорость потока примерно 25 мл/час. Последовательные фракции элюата должны быть собраны и проанализированы выбранным методом.

Процедура измерения

Для определения растворимости в воде используют фракции из среднего диапазона элюата, где концентрации постоянны (± 30 %) не менее чем в пяти последовательных фракциях.

Второй прогон должен выполняться при половине расхода первого. Если результаты двух прогонов совпадают, испытание считается удовлетворительным; если наблюдается более высокая кажущаяся растворимость при более низкой скорости потока, то уменьшение скорости потока вдвое должно продолжаться до тех пор, пока два последовательных опыта не дадут одинаковую растворимость.

В обоих случаях (с использованием рециркуляционного насоса или уравнительного сосуда) фракции следует проверять на наличие коллоидных веществ путем исследования эффекта Тиндаля (рассеяния света). Присутствие таких частиц делает результаты недействительными, и испытание следует повторить с улучшением фильтрующего действия колонки. Необходимо записать pH каждого образца. Второй прогон следует провести при той же температуре.

1.6.4. Колбовой метод 1.6.4.1. Аппарат

Для колбового метода необходимы следующие материалы: - обычная лабораторная посуда и приборы,

- устройство, подходящее для перемешивания растворов при контролируемых постоянных температурах,

- центрифуга (предпочтительно с термостатом), если требуется для эмульсий, и

- оборудование для аналитического определения.

1.6.4.2. Процедура измерения

Количество материала, необходимое для насыщения желаемого объема воды, оценивается по результатам предварительного испытания. Требуемый объем воды будет зависеть от аналитического метода и диапазона растворимости. В каждый из трех стеклянных сосудов, снабженных стеклянными пробками (например, центрифужных пробирок, колб), взвешивают примерно в пять раз большее количество материала, определенное выше. В каждый сосуд добавляют выбранный объем воды и плотно закрывают сосуды. Затем закрытые сосуды перемешивают при температуре 30°С. (Необходимо использовать устройство для встряхивания или перемешивания, способное работать при постоянной температуре, например, магнитное перемешивание на водяной бане с термостатом). Через сутки один из сосудов вынимают и снова уравновешивают на 24 часа при температуре испытания, периодически встряхивая. Затем содержимое сосуда центрифугируют при температуре испытания и концентрацию соединения в прозрачной водной фазе определяют подходящим аналитическим методом. Остальные две колбы обрабатывают аналогичным образом после первоначального уравновешивания при 30°С в течение двух и трех дней соответственно. Если результаты концентрации по крайней мере в двух последних сосудах соответствуют требуемой воспроизводимости, тест считается удовлетворительным. Весь тест следует повторить, используя более длительное время установления равновесия, если результаты сосудов 1, 2 и 3 демонстрируют тенденцию к увеличению значений.

Необходимо записать pH каждого образца.

1.6.5. Анализ

Для этих определений предпочтительнее использовать аналитический метод, специфичный для конкретного вещества, поскольку небольшие количества растворимых примесей могут вызвать большие ошибки в измерении растворимости. Примерами таких методов являются: газовая или жидкостная хроматография, методы титрования, фотометрические методы, вольтаметрические методы.

2. ДАННЫЕ 2.1. Колоночный метод элюирования

Среднее значение по крайней мере пяти последовательных проб, взятых с плато насыщения, должно рассчитываться для каждого анализа, как и стандартное отклонение.

2.2. Колбовой метод

Отдельные результаты должны быть приведены для каждой из трех колб, а те результаты, которые считаются постоянными (повторяемость менее 15 %), должны быть усреднены и выражены в единицах массы на объем раствора. Это может потребовать обратного преобразования единиц массы в единицы объема с использованием плотности, когда растворимость очень высока (> 100 граммов на литр).

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Колоночный метод элюирования

Отчет должен, если возможно, содержать данные о результатах предварительного испытания, а также следующую информацию: - точное описание вещества (идентичность и примеси);

- индивидуальные концентрации, скорости потока и pH каждого образца,

- средние значения и стандартные отклонения по меньшей мере пяти образцов с плато насыщения каждого анализа,

- среднее значение двух последовательных приемлемых прогонов,

- температура воды в процессе насыщения,

- используемый метод анализа,

- характер используемого вспомогательного материала,

- загрузка вспомогательного материала,

- используемый растворитель,

- доказательства какой-либо химической нестабильности вещества во время испытания и использованного метода,

- вся информация, необходимая для интерпретации результатов.

3.2. Колбовой метод

Отчет должен, по возможности, включать следующую информацию: - точное описание вещества (идентичность и примеси),

- отдельные аналитические определения и среднее значение, если для каждой колбы определяли более одного значения,

- pH каждого образца,

- среднее значение для разных колб, которые оказались согласованными,

- температура испытания,

- используемый аналитический метод,

- доказательства какой-либо химической нестабильности вещества во время испытания и использованного метода,

- вся информация, необходимая для интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 105, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 116, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027382">

>ФАЙЛ ПИК="T0027383">

>PIC-ФАЙЛ="T0027384">

>ФАЙЛ ПИК="T0027385">

А. 7. ЖИРОРАСТВОРИМОСТЬ

1. МЕТОД

Описанный метод основан на Руководстве для испытаний ОЭСР (1) 1.1. Введение

Для проведения этого испытания полезно иметь предварительную информацию о коэффициенте распределения, растворимости в воде, структурной формуле и стабильности вещества при 50 °C. Этот метод применим только к тем веществам, которые по существу чисты, стабильны при 50 °С и не обладают заметной летучестью в тех же условиях.

Метод не пригоден для тестируемых веществ, реагирующих с триглицеридами.

1.2. Определения и единицы измерения

Массовая доля вещества, образующая гомогенную фазу с жидким жиром (маслом), не вызывая при этом химических реакций, называется жирорастворимостью. Максимум такой массовой доли называется массовой долей насыщения и зависит от температуры.

Массовую долю насыщения вещества следует указывать в миллиграммах на 100 г стандартного жира при температуре 37 ± 0,5 °С.

Между растворимостью в граммах на 100 г раствора (S') и растворимостью в граммах на 100 г растворителя (S) существует следующая зависимость: >PIC FILE= "T0027386">

Умножение значения S на 1000 дает миллиграммы на 100 г стандартного жира.

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечивать возможность сравнения результатов при применении другого метода.

1.4. Принцип метода

Вещество добавляют в жидкость «стандартного жира» и перемешивают. Добавляется достаточное количество вещества, чтобы обеспечить избыток. Растворенное количество испытуемого вещества следует определять подходящим аналитическим методом.

1,5. Критерии качества 1.5.1. Специфика

Воспроизводимость измерений в настоящее время неизвестна.

Результаты должны быть применимы к стандартным жирам и подходят для относительно чистых веществ. Даже при температуре 37 °C жиры могут образовывать эмульсии или мелкую суспензию твердых веществ. Поскольку они будут мешать последующему определению массовой доли, их образования следует избегать.

1.6. Описание метода 1.6.1. Подготовка 1.6.1.1. Аппарат

Требуются следующие предметы оборудования: - обычная лабораторная посуда,

- баланс,

- центрифуга с термостатом,

- мешалка, которую можно использовать в сочетании с системой контроля температуры,

- термостат.

1.6.1.2. Стандартные жиры

Необходимо использование стандартных жиров. Эти стандарты жиров должны быть легко определяемыми, и пример такого стандартного жира приведен в Приложении.

1.6.1.3. Предварительный тест

Следует провести упрощенное предварительное испытание для определения приблизительного количества вещества, необходимого для установления массовой доли насыщения при температуре испытания (37 °С).

Примечание

Скорость установления равновесия насыщения может сильно зависеть от размера частиц в случае твердых веществ. По этой причине такие материалы следует измельчать.

1.6.1.4. Приготовление вещества

Взвесьте восемь образцов в колбы емкостью 50 мл. Обычно каждого из них должно быть в два раза больше, чем необходимо для насыщения, как определено в предварительном тесте.

После добавления навески около 25 г сжиженного и смешанного стандартного жира колбы, снабженные мешалками, плотно закрывают притертыми стеклянными пробками. Одну половину (группа I) перемешивают при 30°С, а другую половину (группа II) примерно при 50°С, каждую в течение по меньшей мере одного часа.

1.6.2. Условия испытаний

Определение жирорастворимости проводят при температуре 37±0,5°С.

1.6.3. Процедура измерения

Содержимое колб обеих групп перемешивают при температуре 37 ± 0,5 °С до полного перемешивания.

Время перемешивания, необходимое для установления равновесия, в целом невозможно предсказать. В случае жидких веществ насыщение может быть достигнуто в течение нескольких минут; в случае твердых веществ это может занять несколько часов. Обычно перемешивание занимает не более трех часов; по истечении этого времени перемешивание следует прекратить в двух колбах из обеих групп и дать этим двум колбам постоять не менее одного часа при 37°С, чтобы отделить нерастворенное количество вещества и обеспечить образование гомогенной фазы. В случае образования эмульсии или суспензии (например, эффект Тиндаля) это необходимо устранить подходящим методом, например, центрифугированием в термостате.

Третью и четвертую колбы в обеих группах следует перемешивать не менее 24 часов, а затем выдерживать в течение одного часа при температуре 37 ± 0,5 °С.

Примечание

Если по истечении этого периода донный осадок (для твердых веществ) не образовался или не произошло разделения фаз (для жидких веществ), испытание необходимо повторить с большим количеством вещества.

1.6.4. Анализ

Для анализа отбирается один образец из каждой фазы насыщенных жиров. Эту пробу взвешивают и определяют массовую долю.

Любой подходящий аналитический метод может быть применен либо непосредственно, либо после экстракции водой или органическим растворителем или любого другого метода разделения.

Примерами таких методов являются: - спектрофотометрия.

- газовая или жидкостная хроматография

- вольтамперометрия

2. ДАННЫЕ

Если имеются значительные различия в результатах из-за недостаточного или перенасыщения, а также коротких и длительных периодов времени, испытание следует повторить с более длительным временем перемешивания.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

В протокол испытаний должна быть включена, по возможности, следующая информация: - точная спецификация вещества (идентификатор и примеси),

- точная спецификация жира (например, описание, характеристики, происхождение, состав),

- метод анализа, отклонения и особенности.

Результаты должны быть оценены, как описано выше, и они являются частью протокола испытаний. Если не было существенных различий между различными наблюдаемыми значениями в миллиграммах на 100 г, следует указать отдельные значения, среднее значение и стандартное отклонение. Если имеются существенные различия даже после повторного тестирования, следует сообщать только отдельные результаты.

Вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, должны быть представлены.

4. ССЫЛКА (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 116, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

Приложение ПРИМЕР ДЛЯ СТАНДАРТНЫХ ЖИРОВ

В следующей таблице показан состав типичного стандартного жира. >ФАЙЛ ПИК="T0027387">

А. 8. КОЭФФИЦИЕНТ РАЗДЕЛЕНИЯ

1. МЕТОД

Описанный метод основан на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Для проведения этого теста полезно иметь предварительную информацию о константе диссоциации, растворимости в воде и поверхностном натяжении вещества.

Этот метод применим только к практически чистому веществу, растворимому в воде и октаноле. Он не применим к поверхностно-активным материалам.

1.2. Определение и единицы измерения

Коэффициент распределения (P) определяется как отношение равновесных концентраций (ci) растворенного вещества в двухфазной системе, состоящей из двух практически несмешивающихся растворителей. В случае н-октанола и воды: >PIC FILE="T0027388">

Таким образом, коэффициент распределения (P) представляет собой частное двух концентраций и обычно задается в виде логарифма по основанию 10 (log P).

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической проверки эффективности метода и обеспечивать возможность сравнения результатов при применении другого метода.

1.4. Принцип метода

Для определения коэффициента распределения необходимо достичь равновесия между всеми взаимодействующими компонентами системы и определить концентрации растворенных в двух фазах веществ. Изучение литературы по этому вопросу показывает, что существует множество различных методов, которые можно использовать для решения этой проблемы, а именно тщательного смешивания двух фаз с последующим их разделением с целью определения равновесной концентрации исследуемого вещества.

1,5. Критерии качества 1.5.1. Повторяемость

Чтобы гарантировать точность коэффициента распределения, необходимо провести повторные определения в трех различных условиях испытания, при этом указанное количество вещества, а также соотношение объемов растворителя могут варьироваться. Определенные значения коэффициента распределения, выраженные в виде их десятых логарифмов, должны находиться в пределах ±0,3 логарифмических единиц.

1.5.2. Чувствительность

Диапазон измерения метода определяется пределом обнаружения аналитической методики. Этого должно быть достаточно, чтобы позволить оценить значения Pow до 105, когда концентрация растворенного вещества в любой фазе не превышает 0,01 моль на литр.

1.5.3. Специфика

Закон распределения Нернста применим только при постоянной температуре, давлении и pH для разбавленных растворов. Это строго относится к чистому веществу, диспергированному между двумя чистыми растворителями. Если в одной или обеих фазах одновременно присутствуют несколько разных растворенных веществ, это может повлиять на результаты.

Диссоциация или ассоциация растворенных молекул приводит к отклонениям от закона распределения Нернста. На такие отклонения указывает тот факт, что коэффициент распределения становится зависимым от концентрации раствора.

Из-за наличия множественных равновесий этот метод испытаний не следует применять к ионизируемым соединениям без внесения поправки. (Для таких соединений следует рассмотреть возможность использования буферных растворов вместо воды.)

1.6. Описание метода 1.6.1. Предварительная оценка коэффициента распределения

Значение коэффициента распределения можно оценить либо посредством простого расчета (2), либо с использованием растворимости испытуемого вещества в чистых растворителях (1):

Для этого: >PIC FILE="T0027389">

Альтернативно, его можно грубо определить, выполнив упрощенный предварительный тест.

1.6.2. Подготовка

н-октанол: Определение коэффициента распределения следует проводить с использованием реактива высокой чистоты аналитического качества.

Вода: следует использовать дистиллированную или бидистиллированную воду из стеклянных или кварцевых приборов.

Примечание

Не следует использовать воду, взятую непосредственно из ионообменника. 1.6.2.1. Предварительное насыщение растворителей

Перед определением коэффициента распределения фазы системы растворителей взаимно насыщаются путем встряхивания при температуре эксперимента. Для этого целесообразно встряхнуть две большие бутыли н-октанола или воды высокой чистоты аналитического качества с достаточным количеством другого растворителя в течение 24 часов на механическом шейкере, а затем дать им постоять достаточно долго, чтобы дать возможность фазы для разделения и достижения состояния насыщения.

1.6.2.2. Подготовка к тесту

Весь объем двухфазной системы должен почти заполнять испытательный сосуд. Это поможет предотвратить потери материала из-за улетучивания. Объемное соотношение и количества используемого вещества определяются следующим образом: - предварительной оценкой коэффициента распределения (см. выше),

- минимальное количество испытуемого вещества, необходимое для аналитической процедуры; и

- ограничение максимальной концентрации в любой фазе 0,01 моль на литр.

Проводятся три теста. В первом добавляется рассчитанное объемное соотношение; во втором добавляется двойной объем н-октанола; а в третьем добавляется половина объема н-октанола.

1.6.2.3. Тестируемое вещество

Для материального баланса во время испытания готовят исходный раствор в н-октаноле с массовой концентрацией от 1 до 100 мг/мл. Фактическая массовая концентрация этого исходного раствора должна быть точно определена до того, как она будет использована для определения коэффициента распределения. Этот раствор следует хранить в стабильных условиях.

1.6.3. Условия испытаний

Температура испытания должна поддерживаться постоянной (± 1 °С) и находиться в диапазоне от 20 до 25 °С.

1.6.4. Процедура измерения 1.6.4.1. Установление равновесия раздела

Для каждого из условий испытания следует подготовить дубликаты испытательных сосудов, содержащих необходимые, точно отмеренные количества двух растворителей вместе с необходимым количеством исходного раствора.

Октанольные части следует измерять по объему. Сосуды для испытаний следует либо поместить в подходящий шейкер, либо встряхнуть вручную. Рекомендуемый метод — быстро повернуть центрифужную пробирку на 180° вокруг ее поперечной оси, чтобы весь захваченный воздух поднялся через две фазы.

1.6.4.2. Разделение фаз

Для разделения фаз следует провести центрифугирование смеси. Это следует делать в лабораторной центрифуге, поддерживаемой при комнатной температуре, или, если используется центрифуга без контроля температуры, центрифужные пробирки следует повторно уравновесить при температуре испытания в течение как минимум одного часа перед анализом.

1.6.5. Анализ

Для определения коэффициента распределения необходимо определить концентрации испытуемого вещества в обеих фазах. Это можно сделать, взяв аликвоту каждой из двух фаз из каждой пробирки для каждого условия испытания и проанализировав ее с помощью выбранной процедуры. Общее количество вещества, присутствующего в обеих фазах, следует рассчитать и сравнить с количеством первоначально введенного вещества.

Пробы водной фазы следует отбирать с помощью процедуры, сводящей к минимуму риск включения следов октанола: для отбора проб водной фазы можно использовать стеклянный шприц со съемной иглой. Первоначально шприц должен быть частично заполнен воздухом. Воздух следует осторожно вытеснять, вставляя иглу через слой октанола. В шприц набирают достаточный объем водной фазы. Шприц быстро вынимают из раствора и отделяют иглу. Содержимое шприца затем можно использовать в качестве водной пробы. Концентрацию в двух разделенных фазах предпочтительно следует определять методом, специфичным для конкретного вещества. Примерами физико-химических определений, которые могут оказаться подходящими, являются: - фотометрические методы,

- газовая хроматография,

- жидкостная хроматография высокого давления.

2. ДАННЫЕ

Если измеренное значение Pow превышает 104, рекомендуется сравнить результаты с расчетным значением Pow, например, полученным методом, приведенным в ссылке 3.

Надежность определенных значений P можно проверить путем сравнения средних значений повторяющихся определений с общим средним значением.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

В отчет по возможности должна быть включена следующая информация: - Точная характеристика вещества (идентификатор и примеси).

- Температура определения.

- Данные об аналитических методиках, использованных при определении концентраций.

- Измеренные концентрации в обеих фазах для каждого определения. (Это означает, что всего будет сообщено о 12 концентрациях.)

- Вес испытуемого вещества, объем каждой фазы, используемой в каждом испытательном сосуде, и общее расчетное количество испытуемого вещества, присутствующего в каждой фазе после уравновешивания.

- Рассчитанные значения коэффициента распределения (P) и среднего значения должны быть указаны для каждого набора условий испытаний, как и средние значения для всех определений. Если есть предположения о концентрационной зависимости коэффициента распределения, это следует отметить в отчете.

- Следует указывать стандартное отклонение отдельных значений P от их среднего значения.

- Среднее значение P всех определений также должно быть выражено в виде логарифма (по основанию 10).

- Рассчитанная теоретическая мощность, если это значение было определено или когда измеренное значение > 104.

- pH используемой воды и водной фазы в ходе эксперимента.

- Вся информация и примечания, имеющие отношение к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 107, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 107, ссылка 2, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(3) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 107, ссылка 10, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

А. 9. ТОЧКА ВСПЫЛКИ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Для проведения этого испытания полезно иметь предварительную информацию о воспламеняемости вещества. Процедура испытания применима к жидким веществам, имеющимся в продаже, пары которых могут воспламеняться от источников воспламенения. Методы испытаний, описанные в этом тексте, надежны только для диапазонов температур вспышки, указанных в отдельных методах.

1.2. Определения и единицы измерения

Температура вспышки — это самая низкая температура, скорректированная на давление 101 325 кПа, при которой испытательная жидкость в закрытом испытательном сосуде выделяет пары в условиях, определенных в методе испытаний, в таком количестве, что в испытательное судно.

Единицы: °С

т = Т - 273,15

(t в °C и T в К)

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны в первую очередь служить для периодической калибровки метода и давать возможность сравнивать результаты при применении другого метода.

1.4. Принцип метода

Вещество помещают в испытательный сосуд, который постепенно нагревают до тех пор, пока концентрация паров в воздухе не достигнет достаточно высокой, чтобы образовалась легковоспламеняющаяся смесь, которая может воспламениться.

1,5. Критерии качества 1.5.1. Повторяемость

Повторяемость варьируется в зависимости от диапазона температуры вспышки и используемого метода испытаний; максимум ± 2 °С.

1.5.2. Чувствительность

Чувствительность зависит от используемого метода тестирования.

1.5.3. Специфика

Специфичность некоторых методов испытаний ограничена определенным диапазоном температур вспышки и зависит от данных, связанных с веществом (например, высокая вязкость).

1.6. Описание метода 1.6.1. Препараты

Образец испытуемого вещества помещают в испытательную аппаратуру согласно 1.6.3.1 и/или 1.6.3.2.

1.6.2. Условия испытаний

Аппарат предпочтительно размещать в месте, защищенном от сквозняков.

1.6.3. Проведение испытания 1.6.3.1. Равновесный метод

См. ИСО 1516, ИСО 3680, ИСО 1523, ИСО 3679.

1.6.3.2. Неравновесный метод

Аппарат Абеля:

См. BS 2000, часть 170, NF M07-011, NF T66-009.

Аппарат Абеля-Пенского:

См. (EN 57), DIN 51755 часть 1 (для температуры от 5 до 65 °C), DIN 51755 часть 2 (для температуры ниже 5 °C), NF M07-036.

Метка аппарата:

См. ASTM D 56, ISO 2719.

Аппарат Пенского-Мартенса:

См. ISO 2719, (EN 11), DIN 51758, ASTM 8013, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Примечания

Если температура вспышки, определенная неравновесным методом в 1.6.3.2, равна: 0 ± 2 °С, 21 ± 2 °С, 55 ± 2 °С, ее следует подтвердить равновесным методом, используя тот же метод. аппарат.

Для уведомления можно использовать только те методы, которые могут определить температуру точки воспламенения.

Для определения температуры вспышки вязких жидкостей (красок, смол и т.п.), содержащих растворители, можно использовать только аппаратуру и методы испытаний, подходящие для определения температуры вспышки вязких жидкостей.

См. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 часть 1.

2. ДАННЫЕ

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет должен, если возможно, включать следующую информацию: - Точную спецификацию вещества (идентификация и примеси).

- Должен быть указан используемый метод, а также любые возможные отклонения.

- Результаты, а также вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, должны быть представлены.

4. ССЫЛКИ

Никто.

А. 10. ВОСПЛАМЕНЯЕМОСТЬ (ТВЕРДЫЕ ВЕЩЕСТВА)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Перед проведением этого испытания полезно иметь предварительную информацию о потенциально взрывоопасных свойствах вещества.

Это испытание следует применять только к порошкообразным, гранулированным и пастообразным веществам.

Чтобы не включать все вещества, которые могут воспламениться, а только те, которые быстро горят или те, чье поведение при горении каким-либо образом особенно опасно, легковоспламеняющимися считаются только вещества, скорость горения которых превышает определенное предельное значение. Более того, металлические порошки, которые могут накаляться, также следует считать легковоспламеняющимися, если накал распространяется по всему образцу. Такое накаливание и связанные с ним трудности при тушении пожара являются основной причиной особой опасности металлических порошков. Обычные средства пожаротушения, такие как углекислый газ и/или вода, могут значительно повысить опасность.

1.2. Определение и единицы измерения

Время горения выражается в секундах.

1.3. Эталонные соединения

Не указан.

1.4. Принцип метода

Вещество в товарном виде сформовано в кучку длиной 250 мм. Затем предпринимают попытку зажечь образец в условиях, определенных в 1.6.3, и измеряют время горения.

1,5. Критерии качества

1.6. Описание метода 1.6.1. Подготовка

В случае порошкообразных и сыпучих веществ продукт в товарной форме расфасовывают в форму неплотно. Форма изготовлена ​​из металла, имеет длину 250 мм, треугольное сечение с внутренней высотой 10 мм и внутренней шириной 20 мм. По обеим сторонам формы в продольном направлении в качестве боковых ограничений установлены два металлических листа, выступающие на 2 мм за верхнюю кромку треугольного сечения (рисунок). Затем форму трижды роняют с высоты 2 см на твердую поверхность. При необходимости форму снова заполняют. Затем снимают боковые ограничения и соскабливают излишки вещества. На форму кладут негорючую и непористую пластину, аппарат переворачивают и форму удаляют.

Пастообразные вещества раскладывают на негорючую поверхность в виде веревки длиной 250 мм и сечением около 1 см2.

Для воспламенения штабеля с одного конца используется любой подходящий источник воспламенения, например небольшое пламя или раскаленная проволока с минимальной температурой 1000 °C.

1.6.2. Условия испытаний

В случае вещества, чувствительного к влаге, испытание следует проводить как можно быстрее после его извлечения из контейнера.

1.6.3. Производительность теста

Подожгите один конец стопки. Когда куча прогорела на расстоянии 80 мм, измерьте скорость горения на следующих 100 мм. Тест проводят шесть раз, каждый раз используя чистую прохладную пластину.

2. ДАННЫЕ

Для оценки необходимы значения времени горения, определенные в ходе шести испытаний.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет по возможности должен включать следующую информацию: - Точную спецификацию вещества (идентификация и примеси).

- Описание испытуемого вещества, его физическое состояние, включая содержание влаги.

- Результаты измерений.

- Все дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

3.2. Интерпретация результата

Порошки, гранулированные или пастообразные вещества считаются легковоспламеняющимися, если время горения в одном из шести испытаний, проводимых по методике испытаний, описанной в 1.6, составляет менее 45 секунд. Порошки металлов или металлических сплавов считаются легковоспламеняющимися, если они могут воспламениться и пламя или зона реакции распространяется по всему образцу.

4. ССЫЛКИ

Никто

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027390">

А. 11. ГОРЮЧЕСТЬ (ГАЗЫ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Этот метод позволяет определить, имеют ли газы, смешанные с воздухом при комнатной температуре и атмосферном давлении, диапазон воспламеняемости. Смеси возрастающих концентраций испытательного газа с воздухом подвергают воздействию электрической искры и наблюдают, происходит ли воспламенение.

1.2. Определение и единицы измерения

Диапазон воспламеняемости – это диапазон концентраций между нижним и верхним пределами взрываемости. Нижним и верхним пределами взрываемости являются такие пределы концентрации горючего газа в смеси с воздухом, при которых распространение пламени не происходит.

1.3. Эталонное вещество

Не указан.

1.4. Принцип метода

Концентрацию газа в воздухе повышают шаг за шагом, и на каждом этапе смесь подвергается воздействию электрической искры.

1,5. Критерии качества

Не указано.

1.6. Описание метода 1.6.1. Аппарат

Испытательный сосуд представляет собой вертикальный стеклянный цилиндр с минимальным внутренним диаметром 50 мм и минимальной высотой 300 мм. Электроды зажигания разнесены на расстояние от 3 до 5 мм и располагаются на высоте 60 мм над дном цилиндра. Цилиндр снабжен отверстием для сброса давления. Аппарат должен быть экранирован, чтобы ограничить ущерб от взрыва.

Стоячая индукционная искра 0,5 сек. В качестве источника воспламенения используется высоковольтный трансформатор с выходным напряжением от 10 до 15 кВ (максимальная потребляемая мощность 300 Вт).

1.6.2. Условия испытаний

Тест необходимо проводить при комнатной температуре.

1.6.3. Производительность теста

С помощью дозирующих насосов в стеклянный цилиндр вводят известную концентрацию газа в воздухе. Через смесь пропускают искру и наблюдают, отрывается ли пламя от источника возгорания и распространяется ли оно самостоятельно. Концентрация газа варьируется с шагом 1 % об. до тех пор, пока не произойдет воспламенение, как описано выше.

2. ДАННЫЕ

Возникновение распространения пламени является единственной значимой информационной информацией для определения этого свойства.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет по возможности должен включать следующую информацию: - Точную спецификацию вещества (идентификация и примеси).

- Описание с размерами используемого аппарата.

- Комнатная температура, при которой проводится тест.

- Испытанные концентрации и полученные результаты.

- Результат испытания: негорючий газ или легковоспламеняющийся газ.

- В случае заключения «негорючее» следует указать, что все концентрации проверялись путем повышения концентрации с шагом 1 %, от 0 до 100 %.

- Должна быть представлена ​​вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

Никто.

А. 12. ГОРЮЧЕСТЬ (ВЕЩЕСТВА И ПРЕПАРАТЫ, КОТОРЫЕ ПРИ КОНТАКТЕ С ВОДОЙ ИЛИ ВЛАЖНЫМ ВОЗДУХОМ ВЫДЕЛЯЮТ ЛЕГКОВОСПЛАМЕНЯЮЩИЕСЯ ГАЗЫ В ОПАСНЫХ КОЛИЧЕСТВАХ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Этот метод испытаний можно использовать для определения того, приводит ли реакция вещества с водой к выделению опасного количества газа или газов, которые могут быть легковоспламеняющимися или токсичными.

Метод испытаний может применяться как к твердым, так и к жидким веществам. Этот метод неприменим к веществам, которые самовозгораются при контакте с воздухом.

1.2. Определения и единицы измерения

Легковоспламеняющиеся: Вещества и препараты, которые при контакте с водой или влажным воздухом выделяют легковоспламеняющиеся газы в опасных количествах с минимальной скоростью 1 литр/кг в час. Этот предел не учитывает токсичность газа.

1.3. Принцип метода

Вещество тестируется в соответствии с пошаговой последовательностью, описанной ниже; если на каком-либо этапе происходит возгорание, дальнейшие испытания не требуются. 1.3.1. Шаг 1

Испытуемое вещество помещают в ванну с дистиллированной водой при температуре 20°С и отмечают, воспламеняется ли выделяющийся газ.

1.3.2. Шаг 2

Испытуемое вещество помещают на фильтровальную бумагу, плавающую на поверхности чашки с дистиллированной водой при температуре 20°С, и отмечают, воспламеняется ли выделяющийся газ. Фильтровальная бумага предназначена лишь для того, чтобы удерживать вещество в одном месте, чтобы увеличить вероятность возгорания.

1.3.3. Шаг 3

Исследуемое вещество собирают в кучу высотой примерно 2 см и диаметром 3 см. В кучу добавляют несколько капель воды и отмечают, воспламенится ли выделяющийся газ.

1.3.4. Шаг 4

Испытуемое вещество смешивают с дистиллированной водой при температуре 20 °C и измеряют скорость выделения газа в течение семи часов с часовыми интервалами. Если скорость эволюции непостоянна или увеличивается по истечении семи часов, время измерения следует продлить максимум до пяти дней. Тест может быть остановлен, если скорость в любой момент превысит 1 литр/кг в час.

1.4. Эталонное вещество

Не указан.

1,5. Критерии качества

Не указано.

1.6. Описание методов 1.6.1. Шаг 1 1.6.1.1. Условия испытаний

Тестируемое вещество используется в том виде, в каком оно продается, и тест проводится при комнатной температуре (около 20 °C).

1.6.1.2. Производительность теста

Небольшое количество (диаметром около 2 мм) испытуемого вещества следует поместить в ванну с дистиллированной водой. Следует отметить, (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли возгорание газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.2. Шаг 2 1.6.2.1. Аппарат

Фильтровальную бумагу кладут плашмя на поверхность дистиллированной воды в любом подходящем сосуде, например испарительная чаша диаметром 100 мм.

1.6.2.2. Условия испытаний

Тестируемое вещество используется в том виде, в каком оно продается, и тест проводится при комнатной температуре (около 20 °C).

1.6.2.3. Производительность теста

Небольшое количество тестируемого вещества (диаметром около 2 мм) помещают в центр фильтровальной бумаги. Следует отметить, (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли возгорание газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.3. Шаг 3 1.6.3.1. Условия испытаний

Тестируемое вещество используется в том виде, в каком оно продается, и тест проводится при комнатной температуре.

1.6.3.2. Производительность теста

Исследуемое вещество складывают в кучку высотой примерно 2 см и диаметром 3 см с углублением наверху. В полость добавляют несколько капель воды и отмечают: (i) выделяется ли какой-либо газ и (ii) происходит ли воспламенение газа. Если происходит возгорание газа, дальнейшее тестирование вещества не требуется, поскольку вещество считается опасным.

1.6.4. Шаг 4 1.6.4.1. Аппарат

Аппарат устанавливают, как показано на рисунке (см. приложение).

1.6.4.2. Условия испытаний

Осмотреть контейнер с испытуемым веществом на наличие порошка. 1.6.4.3. Производительность теста

В капельную воронку аппарата наливают воду и отвешивают достаточное количество вещества, максимальный вес которого не превышает 25 г, для образования от 100 до 250 см3 газа, и помещают в коническую колбу. Объем выделившегося газа можно измерить любым подходящим способом. Открывают кран капельной воронки для спуска воды в коническую колбу и включают секундомер. Отмечают время, необходимое для выделения всего газа, и, где это возможно, следует снять промежуточные показания. Этот тест следует проводить в трех экземплярах.

Если химическая принадлежность газа неизвестна, газ необходимо проанализировать. Если газ содержит легковоспламеняющиеся компоненты и неизвестно, является ли вся смесь легковоспламеняющейся, необходимо приготовить смесь того же состава и испытать ее по методу испытаний (А.11).

2. ДАННЫЕ

Одного возгорания или выделения легковоспламеняющегося газа со скоростью более 1 л/кг в час за три попытки достаточно, чтобы признать испытуемое вещество опасным (1.6.1, 1.6.2 и 1.6.3).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет должен, по возможности, включать следующую информацию: - Точную спецификацию и описание полученного вещества (например, цвет, размер частиц и физическое состояние).

- Любая первоначальная подготовка испытуемого вещества.

- Результаты испытаний.

- Химическая принадлежность газа изменилась.

- Скорость выделения газа (1.6.4).

- Любые дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ (1) ISO 1773.

(2) ОЭСР, Париж, Предварительное руководство по определению веществ, выделяющих легковоспламеняющиеся газы в опасных количествах при контакте с водой, А 80/28, окончательный отчет программы химических испытаний ОЭСР.

(3) Док. ООН. Нет ST/SG/AC10/1 ред. 1.

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027391">

А. 13. ГОРЮЧЕСТЬ (ТВЕРДЫЕ ВЕЩЕСТВА И ЖИДКОСТИ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Полезно иметь предварительную информацию о самовоспламеняемости вещества. Процедура испытания применима к твердым и жидким веществам, имеющимся в продаже, которые в небольших количествах самопроизвольно воспламеняются через короткое время после контакта с воздухом при комнатной температуре.

Веществами, не охватываемыми данным методом испытаний, являются вещества, которым необходимо несколько часов или дней храниться при комнатной температуре, прежде чем произойдет самовоспламенение, или вещества, которые необходимо подвергнуть воздействию значительно более высокой температуры, прежде чем произойдет самовоспламенение.

1.2. Определения и единицы измерения

Жидкости и твердые вещества считаются легковоспламеняющимися, если они воспламеняются хотя бы один раз из шести испытаний в условиях, описанных в 1.6.

Самовоспламеняемость жидкостей также может потребоваться проверить по методу А.15: Самовоспламеняемость: определение температуры самовоспламенения летучих жидкостей и газов.

1.3. Эталонные вещества

Не указан.

1.4. Принцип метода

Вещество контактируют с воздухом при температуре 25 ± 10 °С в течение пяти минут. В случае возгорания вещество считается легковоспламеняющимся.

1,5. Критерии качества

Повторяемость: из-за важности с точки зрения безопасности только одного положительного результата из шести испытаний достаточно, чтобы признать вещество легковоспламеняющимся.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Аппарат

Фарфоровую чашку диаметром около 10 см заполняют диатомитом на высоту около 5 мм при комнатной температуре.

Примечание

Кизельгур или любое другое аналогичное инертное вещество, которое обычно доступно, следует рассматривать как образец почвы, на которую может быть пролито испытуемое вещество в случае аварии.

1.6.2. Проведение испытания а) Порошкообразные твердые вещества

От 1 до 2 см3 испытуемого порошкообразного вещества высыпают с высоты около 1 м на негорючую поверхность и наблюдают, воспламеняется ли вещество при падении или в течение пяти минут после осаждения.

(б) Жидкости

В подготовленную фарфоровую чашку наливают около 5 см3 испытуемой жидкости и наблюдают, воспламеняется ли вещество в течение пяти минут.

2. ДАННЫЕ

Для оценки имеют значение результаты шести тестов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет должен, если возможно, включать следующую информацию: Описание вещества, подлежащего испытанию.

- Результаты теста.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, Предварительное руководство по определению пирофорности твердых веществ и жидкостей, A 80/23, окончательный отчет программы химических испытаний ОЭСР.

А. 14. ВЗРЫВЧАТЫЕ СВОЙСТВА

1. МЕТОД 1.1. Введение

Метод представляет собой схему испытаний для определения того, представляет ли твердое, жидкое или пастообразное вещество или препарат опасность взрыва при воздействии пламени (термическая чувствительность), ударе или трении (чувствительность к механическим раздражителям). ).

Метод состоит из трех частей: (а) испытание на термическую чувствительность;

(б) испытание на механическую чувствительность к удару;

(c) испытание механической чувствительности к трению.

Метод дает данные для оценки вероятности инициирования взрыва с помощью некоторых общих стимулов. Метод не предназначен для установления того, способно ли вещество или препарат взорваться при каких-либо условиях; он также не предназначен для определения степени, до которой первоначальное разложение может распространиться и вызвать взрыв всего образца.

Метод подходит для определения того, будет ли вещество или препарат представлять опасность взрыва (термическая и механическая чувствительность) в конкретных условиях, указанных в директиве. Испытания не имеют значения, если имеющаяся термодинамическая информация (теплота образования, теплота разложения, отсутствие определенных реакционноспособных групп (1) в структурной формуле) устанавливает вне всякого разумного сомнения, что вещество или препарат не способны к разложению, образованию газов и выделению тепла очень сильно. быстро (т.е. материал не представляет опасности взрыва). Признается, что метод не является окончательным. Он включает в себя ряд выбранных типов определенного оборудования, которые широко используются во всем мире и обычно дают значимые результаты.

Лицо, проводящее испытания, может решить использовать альтернативное оборудование в трех указанных методах, при условии, что это может быть научно обосновано и оборудование признано на международном уровне. В этом случае он должен определить соотношение своих результатов с результатами, полученными на указанной аппаратуре.

1.2. Определения и единицы измерения

Взрывной:

Вещества и препараты, которые могут взрываться под действием пламени или более чувствительны к ударам или трению, чем динитробензол.

1.3. Эталонное вещество

Мета-динитробензол, технический кристаллический продукт, для трения и ударного метода.

1.4. Принцип метода

Предварительный скрининговый тест необходим для создания безопасных условий для проведения трех тестов на чувствительность: 1.4.1. Предварительный скрининговый тест

Очень маленькие образцы (около 10 мг) вещества или препарата подвергают нагреву без удержания в пламени Бунзена, удару в любом удобном устройстве и трению с помощью молотка о наковальню или любого другого механизма трения. . Целью является выяснить, является ли вещество настолько чувствительным и взрывоопасным, что предписанные тесты на чувствительность следует проводить с особыми мерами предосторожности во избежание травмирования экспериментатора.

1.4.2. Термическая чувствительность

Этот метод включает нагревание вещества или препарата в стальной трубке, при этом различные степени удержания обеспечиваются сопловыми пластинами с разными диаметрами отверстий, чтобы определить, может ли вещество или препарат взорваться в условиях термического напряжения.

1.4.3. Механическая чувствительность (шок)

Этот метод включает в себя воздействие на вещество или препарат ударом падающего молотка на стальную наковальню.

1.4.4. Механическая чувствительность (трение)

Метод заключается в том, что вещество или препарат подвергают трению между стандартными поверхностями при заданных условиях нагрузки и относительного движения.

1,5. Критерии качества

Не указано.

1.6. Описание метода 1.6.1. Аппарат 1.6.1.1. Термическая чувствительность (эффект пламени)

Стальная труба изготавливается из листа глубокой вытяжки (см. Приложение) методом волочения. Он имеет внутренний диаметр 24 мм, длину 75 мм и толщину стенок 0,5 мм. На открытом конце трубка снабжена фланцем для закрытия трубки (рисунок 1). Трубка снабжена устойчивой к давлению круглой пластиной сопла с центральным отверстием, которая прочно крепится к трубке с помощью винтового соединения, состоящего из двух частей (гайка и накидная гайка). Сопловая пластина (см. рис. 1) толщиной 6 мм изготовлена ​​из жаропрочной хромистой стали (см. Приложение).

Ассортимент насадок различного диаметра отверстия (1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20... мм) доступны экспериментатору для определения степени опасности взрыва, которую представляет вещество или препарат. Гайка и накидная гайка (рисунок 1) изготовлены из хромомарганцевой стали (см. Приложение), не вызывающей искр до температуры 800 °C. Стальные трубки используются только для одного эксперимента.

1.6.1.2. Механическая чувствительность (шок)

Типичный аппарат падающей массы состоит по существу из литого стального блока (серого литья) с основанием и наковальней, колонны, направляющих, падающего груза и механизма спуска. Стальной блок 230 мм (глубина) × 250 мм (ширина) × 200 мм (высота) с литым основанием 450 мм (глубина) × 450 мм (ширина) × 60 мм (высота) несет стальную наковальню диаметром 100 мм. × 70 мм (высота), который прикручивается. Сзади к стальному блоку прикручивается держатель, в котором крепится колонна, состоящая из бесшовной тянутой стальной трубы диаметром 90 мм (наружный диаметр) и 70 мм (внутренний диаметр). Четыре шурупа, закрепленные в прочном бетонном блоке размером 60 × 60 × 60 см, удерживают падающий молот таким образом, что рельсы располагаются абсолютно вертикально, а падающий груз легко направляется. Масса грузика падающего молота должна составлять 10 килограммов. Вес состоит из прочной стали. Он должен иметь ударную поверхность из закаленной стали, твердость HRC от 60 до 63 и минимальный диаметр 25 мм. Испытания проводятся при высоте падения 0,4 м.

Исследуемый образец помещается в фильерное устройство, состоящее из двух сплошных коаксиальных стальных цилиндров, расположенных один над другим, и полого стального цилиндра в качестве направляющего кольца. Цельнолитые стальные цилиндры должны иметь диаметр 10 (- 0,003, - 0,005) мм и высоту 10 мм, иметь полированные поверхности, закругленные края (радиус кривизны 0,5 мм) и твердость от 58 до 65 HRC. Полый цилиндр должен имеют наружный диаметр 16 мм, полированное отверстие 10 (+0,005, +0,010) мм и высоту 13 мм. В случае взрыва стальные цилиндры и полый цилиндр не следует использовать для дальнейших испытаний. Матричное устройство установлено на промежуточной опоре 26 мм (диаметр) × 26 мм (высота), изготовленной из стали и центрированной центрирующим кольцом с фиксирующим кольцом для отвода дымов взрыва.

1.6.1.3. Механическая чувствительность (трение)

Аппарат трения состоит из литой стальной опорной плиты (серого литья), на которой установлено само фрикционное устройство, состоящее из неподвижного фарфорового штифта и подвижных фарфоровых пластин. Фарфоровая тарелка закреплена в выдвижной люльке, перемещающейся между двумя направляющими. Люлька приводится в движение посредством приводного стержня, эксцентрикового шкива и передаточного механизма с помощью электродвигателя таким образом, что фарфоровая пластина перемещается под фарфоровым стержнем с движением вперед и назад на 10 мм. Фарфоровый колышек должен быть нагружен силой около 360 ньютонов.

Фарфоровые тарелки изготовлены из белого технического фарфора и имеют размеры 25 мм (длина) х 25 мм (ширина) × 5 мм (высота). Обе поверхности трения пластин перед обжигом загрубляются (грубая глубина от 9 до 32 м) путем протирания губкой.

Цилиндрический фарфоровый колышек также изготовлен из белого технического фарфора. Его длина 15 мм, диаметр 10 мм и шероховатые сферические торцевые поверхности с радиусом кривизны 10 мм.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Термическая чувствительность (эффект пламени)

Вещество в том физическом виде, в котором оно должно быть подано, засыпается в трубку на высоту 60 мм тремя равными порциями. Каждый прирост аккуратно уплотняется путем приложения к поверхности силы в 80 ньютонов с помощью подходящего деревянного поршня, немного меньшего, чем трубка. В случае желеобразного вещества необходимо следить за тем, чтобы во время наполнения не образовывались пузырьки воздуха.

1.6.2.2. Механическая чувствительность (шок)

Вещество тестируется в сухом состоянии. Образец должен иметь объем 40 мм3 или объем, соответствующий указанному аппарату. Для твердых веществ, за исключением паст, применяются следующие правила: (а) порошкообразные вещества просеиваются (размер сита 0,5 мм); все, что прошло через сито, используется для проверки;

(b) прессованные, литые или иным образом конденсированные вещества измельчаются и просеиваются; для испытания используют сито фракции диаметром от 0,5 до 1 мм.

При использовании жидких веществ верхний стальной цилиндр прижимают до тех пор, пока он не окажется на расстоянии 1 мм от нижнего цилиндра, и удерживают его в этом положении.

1.6.2.3. Механическая чувствительность (трение)

Вещество тестируется в сухом состоянии. Образец должен иметь объем 10 мм3. Для твердых веществ, за исключением паст, применяются следующие правила: (а) порошкообразные вещества просеиваются (размер сита 0,5 мм); все, что прошло через сито, используется для проверки;

(б) прессованные, литые или иным образом конденсированные вещества измельчают и просеивают; ситовидная фракция

1.6.3. Выполнение тестов. 1.6.3.1. Термическая чувствительность (эффект пламени)

Нагрев осуществляется пропаном, который забирается из промышленного баллона, оснащенного регулятором давления (500 мбар), через счетчик и распределяется по коллектору на четыре горелки. Четыре горелки потребляют 3,2 литра пропана в минуту. Если используются другие нагревательные газы, необходимо выбрать соответствующие горелки, расход газа, приток воздуха так, чтобы для сравнительных измерений с инертными веществами (песок, дибутилфталат) были получены такие же температурно-временные кривые, как и для нагрева пропаном в заполненных трубах. зарегистрированы.

Горелки расположены вокруг испытательной камеры, как показано на рисунке 2.

Горелки отрегулированы таким образом, чтобы кончик внутреннего голубого конуса пламени почти касался трубки. Испытание следует проводить в стальной камере, размеры которой указаны на рисунке 2.

Размеры горелок для пропана приведены на рисунках 3а и 3б. Обязательны две серии по три испытания: в первой серии используется пластина с соплом с отверстием диаметром 2 мм, во второй - с отверстием диаметром более 2 мм (например, 6 мм).

Если взрыв произошел во время первой серии (отверстие 2 мм), нет необходимости переходить к следующей серии. Если через пять минут взрыва не происходит, испытание прекращают.

1.6.3.2. Механическая чувствительность (шок)

В указанном ударном аппарате проводят шесть испытаний падением массы 10 кг с высоты 0,4 м. В других аппаратах пробу сравнивают с м-динитробензолом по установленной методике (метод «вверх-вниз» и др.).

1.6.3.3. Механическая чувствительность (трение)

На испытуемый образец подносят фарфоровый колышек и подвешивают гирю. При проведении испытания следы губки на фарфоровой пластине должны располагаться поперек направления движения. Необходимо следить за тем, чтобы стержень опирался на образец, чтобы под стержнем лежало достаточное количество испытуемого материала, а также чтобы пластина правильно двигалась под стержнем. Фарфоровую пластину необходимо перемещать под фарфоровым штифтом вперед и назад на расстояние 10 мм в каждую сторону за время 0,44 секунды. Каждую часть поверхности можно использовать только для одного испытания.

2. ДАННЫЕ 2.1. Обработка результатов

Тестирование может быть прекращено при получении положительного результата в одном из тестов.

2.2. Оценка

В принципе, считается, что вещество или препарат представляет опасность взрыва в смысле директивы, если: (a) происходит взрыв (т. е. трубка разрывается на три или более фрагментов) в течение установленного количества испытаний на термическую чувствительность; или

(б) взрыв (возгорание пламени эквивалентно взрыву) происходит по крайней мере один раз из шести испытаний с указанным ударным устройством или образец более чувствителен, чем м-динитробензол в альтернативном испытании на удар; или

(c) взрыв (крепитация или возгорание эквивалентны взрыву) происходит по крайней мере один раз в шести испытаниях с указанным аппаратом трения или образец более чувствителен, чем м-динитробензол в альтернативном испытании на трение.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен, по возможности, включать следующую информацию: - идентичность, состав, чистота, содержание влаги и т. д. испытуемого вещества или препарата;

- физическая форма образца и то, был ли он просеян или нет,

- наблюдения во время испытаний (тип реакции, искры, пламя, взрыв, количество осколков и т.п.),

- результаты каждого теста,

- если использовалась альтернативная аппаратура, должно быть предоставлено научное обоснование, а также доказательства корреляции между результатами, полученными с помощью указанной аппаратуры, и результатами, полученными с помощью эквивалентной аппаратуры,

- любые полезные комментарии, такие как ссылки на испытания аналогичных продуктов, которые могут иметь отношение к правильной интерпретации результатов.

3.2. Интерпретация и оценка результатов

В отчете об испытаниях должны быть упомянуты любые результаты, которые считаются ложными, аномальными или нерепрезентативными. Если какой-либо из результатов следует не принимать во внимание, следует предоставить объяснение и результаты любого альтернативного или дополнительного тестирования.

Иногда результатом может быть артефакт, связанный с физической формой или летучей природой вещества или препарата во время испытания; в таком случае полезно знать, какой результат можно получить, если вещество или препарат находится в той форме, в которой оно должно быть размещено на рынке. Альтернативное тестирование может помочь определить эту информацию. Если аномальный результат не может быть объяснен таким образом, его следует принять за чистую монету и использовать для соответствующей классификации вещества или препарата.

4. ССЫЛКИ (1) Бретерик, Л., Справочник по реактивным химическим опасностям, Лондон, Баттервортс, 1979, стр. 60–63.

(2) Коенен, Х., Иде, К.Х., Об испытаниях взрывчатых веществ, I. Определение чувствительности к трению, Взрывчатые вещества, том. 3, 1955, стр. 57–65 и 89–93.

(3) Коенен, Х., Иде, К.Х., Об испытаниях взрывчатых веществ, III. Определение чувствительности взрывчатых веществ к тепловым нагрузкам в нагревательной камере с различными заданными отверстиями (метод стального корпуса), Взрывчатые вещества, вып. 4, 1956, стр. 119–125 и 143–148.

(4) Коенен Х., Иде К.Х., Хаупт В., Об испытаниях взрывчатых веществ, IV.Определение чувствительности к удару взрывчатых веществ твердой, жидкой и студенистой природы, Взрывчатые вещества, т. 1, с. 6, 1958, стр. 178–189, 202–214 и 223–235.

(5) ОНУ, 1980 г., декабрь, Комитет экспертов ООН по перевозке опасных грузов (док. ST/SG/AC/.10/5/Add.3, таблица 4.3).

Приложение Пример спецификации материала

(1) Спецификация материала № 1.0336.505 г, в соответствии с DIN 1623, лист 1.

(2) Спецификация материала № 1.4873 в соответствии с листом «Stahl-Iron-Werkstoff» 490-52.

(3) Спецификация материала № 1.3817 в соответствии с листом «Stahl-Iron-Werkstoff» 490-52.

>ФАЙЛ ПИК="T0027392">

>ФАЙЛ ПИК="T0027393">

>PIC-ФАЙЛ="T0027394">

>ФАЙЛ ПИК="T0027395">

А. 15. САМОВОСпламеняемость (ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ САМОВОСПЛАМЕНЕНИЯ ЛЕТУЧИХ ЖИДКОСТЕЙ И ГАЗОВ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Полезно иметь предварительную информацию о самовоспламеняемости вещества. Процедура испытания применима к газообразным и летучим жидким веществам, имеющимся в продаже, которые или пары которых могут воспламениться в присутствии воздуха от горячей поверхности. Температуру самовоспламенения можно значительно снизить за счет присутствия каталитических примесей.

1.2. Определения и единицы измерения

Степень самовоспламеняемости выражается через температуру самовоспламенения. Температура самовоспламенения — это самая низкая температура, при которой испытуемое вещество воспламеняется при смешивании с воздухом в условиях, определенных в методе испытаний.

1.3. Эталонные вещества

Не указан.

1.4. Принцип метода

Самовоспламеняемость газов и паров определяют с помощью прибора, описанного в IEC 79-4.

1,5. Критерии качества

Повторяемость варьируется в зависимости от диапазона температур самовоспламенения и используемого метода испытаний (макс. ± 5 °C).

Чувствительность зависит от используемого метода тестирования.

Специфичность зависит от используемого метода тестирования.

1.6. Описание метода 1.6.1. Аппарат

Устройство описано в методе, указанном в 1.6.3.

1.6.2. Условия испытаний

Образец испытуемого вещества испытывают по методу, указанному в 1.6.3.

1.6.3. Производительность теста

См. МЭК 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056.

2. ДАННЫЕ

Запишите температуру испытания, атмосферное давление, количество использованной пробы, время задержки до воспламенения.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет должен, если возможно, включать следующую информацию: - точную спецификацию вещества (идентификация и примеси),

- количество используемой пробы, атмосферное давление,

- результаты измерений (температуры испытаний, результаты воспламенения, соответствующие временные задержки),

- все дополнительные замечания, относящиеся к интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

Никто.

А. 16. САМОВОСпламеняемость (ТВЕРДЫЕ ВЕЩЕСТВА – ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ САМОВОСПЛАМЕНЕНИЯ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

Этому испытанию должны подвергаться взрывчатые вещества и вещества, которые самовозгораются при контакте с воздухом при температуре окружающей среды.

Целью этого испытания является предоставление предварительной информации о самовоспламеняемости твердых веществ при повышенных температурах.

Если тепло, выделяемое либо в результате реакции вещества с кислородом, либо в результате экзотермического разложения, не отдается достаточно быстро в окружающую среду, происходит саморазогрев, приводящий к самовозгоранию. Таким образом, самовоспламенение происходит, когда скорость выделения тепла превышает скорость теплоотдачи.

Процедура испытания полезна в качестве предварительного проверочного теста на наличие твердых веществ. Ввиду сложного характера воспламенения и горения твердых веществ температуру самовоспламенения, определенную в соответствии с данным методом испытаний, следует использовать только в целях сравнения.

1.2. Определения и единицы измерения

Температура самовоспламенения, полученная этим методом, представляет собой минимальную температуру окружающей среды, выраженную в °C, при которой определенный объем вещества воспламеняется при определенных условиях.

1.3. Эталонное вещество

Никто.

1.4. Принцип метода

Определенный объем испытуемого вещества помещают в печь при комнатной температуре; кривую температуры/времени, относящуюся к условиям в центре образца, записывают при повышении температуры печи до 400°С со скоростью 0,5°С/мин. Температура печи, при которой температура образца достигает 400 °С в результате саморазогрева, для целей данного испытания называется температурой самовоспламенения.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода 1.6.1. Аппарат 1.6.1.1. Печь

Лабораторная печь с программируемой температурой (объем около 2 литров), оснащенная естественной циркуляцией воздуха и защитой от взрыва. Необходимо обеспечить, чтобы газы разложения не вступали в контакт с электрическими нагревательными элементами, чтобы избежать потенциального риска взрыва.

1.6.1.2. Куб из проволочной сетки

Кусок проволочной сетки из нержавеющей стали с отверстиями 0,045 мм будет отрезан по схеме, показанной на рисунке 1 (см. Приложение). Сетку складывают и закрепляют проволокой в ​​виде кубиков с открытым верхом.

1.6.1.3. Термопары

Подходящие термопары.

1.6.1.4. Регистратор

Любой двухканальный самописец, откалиброванный от 0 до 600 °С или соответствующего напряжения.

1.6.2. Условия испытаний

Вещества тестируются в товарной форме.

1.6.3. Производительность теста

Куб наполняют тестируемым веществом и осторожно постукивают, добавляя еще вещество до тех пор, пока куб не заполнится полностью. Затем образец подвешивают в центре печи при комнатной температуре. Одну термопару помещают в центр куба, а другую — между кубом и стенкой печи для регистрации температуры печи.

Температуру печи и образца непрерывно регистрируют, пока температура печи повышается до 400°С или до температуры плавления твердого вещества, если она ниже, со скоростью 0,5°С/мин.

При воспламенении вещества термопара образца покажет очень резкий подъем температуры выше температуры печи.

2. ДАННЫЕ

Для оценки важна температура печи, при которой температура образца достигает 400 °C в результате саморазогрева (см. рисунок 2 в Приложении).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет должен, если возможно, включать следующую информацию: - описание вещества, подлежащего испытанию;

- результаты измерений, включая кривую температура/время,

- все дополнительные замечания, имеющие значение для интерпретации результатов.

4. ССЫЛКИ

Никто.

Приложение

>PIC-ФАЙЛ="T0027396">

А. 17. ОКИСЛЯЮЩИЕ СВОЙСТВА

1. МЕТОД 1.1. Введение

Перед проведением этого испытания полезно получить предварительную информацию о потенциально взрывоопасных свойствах и токсичности вещества.

Это испытание не применимо к жидкостям и газам, взрывоопасным или легковоспламеняющимся веществам, органическим пероксидам или горючим твердым веществам, способным плавиться в условиях испытания.

Это испытание не имеет значения, если исследование структурной формулы вне всякого разумного сомнения устанавливает, что вещество или препарат не способны вступать в экзотермическую реакцию с горючим материалом.

Чтобы определить, следует ли проводить испытание с особыми мерами предосторожности, следует провести предварительное испытание.

1.2. Определение и единицы измерения

Время горения: время реакции, в секундах, необходимое для перемещения зоны реакции вдоль штабеля в соответствии с процедурой, описанной в 1.6.

Скорость горения: выражается в миллиметрах в секунду.

Максимальная скорость горения: самые высокие значения скорости горения, полученные для смесей, содержащих от 10 до 90% окислителя по массе.

1.3. Эталонное вещество

Нитрат бария (ч.д.а.) используется в качестве эталонного вещества для теста и предварительного теста.

В предварительных испытаниях также можно было использовать дихромат калия.

При обращении с дихроматом калия следует соблюдать особые меры предосторожности.

Эталонной смесью является та смесь нитрата бария с порошкообразной целлюлозой, приготовленная по 1.6, которая имеет максимальную скорость горения (обычно смесь с 60 % нитрата бария по массе).

1.4. Принцип метода

Предварительное испытание проводится в целях безопасности. Испытания будет достаточно, если предварительное испытание ясно покажет, что испытуемое вещество или препарат обладает окислительными свойствами. Если это не так, вещество или препарат подлежат дальнейшему испытанию.

В ходе дальнейшего испытания испытуемое вещество и определенное горючее вещество будут смешаны в различных соотношениях. Затем каждая смесь формируется в кучу, и куча поджигается с одного конца. Определенную максимальную скорость горения сравнивают с максимальной скоростью горения эталонной смеси.

1,5. Критерии качества

При необходимости допускается любой способ измельчения и смешивания при условии, что разница максимальной скорости горения в шести отдельных испытаниях отличается от среднеарифметического значения не более чем на 10 %.

1.6. Описание метода 1.6.1. Предварительный тест

Вещество в товарной форме высушивается. Высушенное вещество грубо смешивают с высушенной целлюлозой или древесной мукой в ​​пропорциях 2 испытуемого вещества к 1 весовой части целлюлозы или древесной муки и из смеси формируют небольшую конусообразную кучку размером 3,5 см ( диаметр основания) × 2,5 см (высота) путем наполнения без утрамбовки конусообразной формы (например, лабораторной стеклянной воронки с закупоренным штоком).

Свая помещается на прохладную непроницаемую непроводящую поверхность над источником возгорания, который состоит из инертной металлической проволоки, такой как платина или никель (которая может нагреваться электрическим током примерно до 1000 °C), расположенной примерно на 1 мм над испытательной поверхностью и который охватывает основание сваи конической формы. Испытание следует проводить в вытяжном шкафу, как указано в 1.6.3.

Источник возгорания включается и остается включенным. Наблюдают и записывают силу и продолжительность результирующей реакции.

Вещество или препарат следует считать окисляющими, если реакция протекает бурно.

В любом случае, если результат вызывает сомнения, необходимо выполнить полный тест поезда, описанный ниже.

1.6.2. Подготовка 1.6.2.1. Тестируемое вещество

Уменьшите испытуемый образец до размера частиц. Просейте испытуемое вещество в его товарном состоянии; оставшуюся фракцию измельчить, процедуру повторять до тех пор, пока вся навеска не пройдет через сито.

Можно использовать любой метод измельчения и просеивания, отвечающий критериям качества.

Перед приготовлением смеси вещество сушат при температуре 105°С до получения постоянной массы. Если температура разложения испытуемого вещества ниже 105 °C, вещество необходимо сушить при подходящей более низкой температуре.

1.6.2.2. Горючее вещество

В качестве горючего вещества используется порошкообразная целлюлоза. Целлюлоза должна быть такого типа, который используется для тонкослойной хроматографии или колоночной хроматографии. Подходящим оказался тип с длиной волокон более 85 % от 0,020 до 0,075 мм. Порошок целлюлозы пропускают через сито с размером ячеек 0,125 мм.

Перед приготовлением смеси порошкообразную целлюлозу сушат при температуре 105°С до достижения постоянной массы.

Если в предварительном испытании используется древесная мука, то приготовьте древесную муку из мягкой древесины, собрав ее часть, прошедшую через сито с размером ячеек 1600 мкм, тщательно перемешайте, затем высушите при температуре 105 °C в течение четырех часов в слой толщиной не более 25 мм. Охладите и храните в герметичном контейнере, наполненном насколько это возможно, до тех пор, пока он не понадобится, желательно в течение 24 часов после высыхания.

1.6.2.3. Смесь

Приготовьте смесь окислителя и целлюлозы, содержащую от 10 до 90 % окислителя по массе с шагом 10 %. В пограничных случаях следует использовать смеси промежуточного окислителя и целлюлозы для более точного достижения максимальной скорости горения.

Примечание

Смеси окислителей с целлюлозой следует рассматривать как потенциально взрывоопасные и обращаться с ними с осторожностью.

Ворс формируется с помощью формы. Форма изготовлена ​​из металла, имеет длину 250 мм, треугольное сечение с внутренней высотой 10 мм и внутренней шириной 20 мм. По обеим сторонам формы в продольном направлении в качестве боковых ограничений установлены два металлических листа, выходящие на 2 мм за верхний край треугольного сечения (рисунок). Эта композиция свободно заполнена смесью с небольшим избытком. После однократного падения формы с высоты 2 см на твердую поверхность остатки излишков вещества соскабливают наклонно расположенным листом. Затем боковые ограничения убираются и остатки пудры разглаживаются валиком. Затем на верхнюю часть формы кладут негорючую пластину, аппарат переворачивают и форму удаляют.

1.6.2.4. Источник зажигания

В качестве источника воспламенения используют пламя газовой горелки или платиновую проволоку, электрически нагретую до температуры примерно 1000°С.

1.6.3. Производительность теста

Разложите кучу поперек сквозняка в вытяжном шкафу.

Скорость воздуха должна быть достаточной, чтобы предотвратить попадание паров в лабораторию, и не должна меняться во время испытания. Вокруг аппарата следует установить защитную ширму.

Из-за гигроскопичности целлюлозы и испытуемых веществ испытание следует проводить как можно быстрее.

Подожгите один конец стопки, коснувшись его пламенем или светящейся платиновой проволокой.

Измерьте время реакции на расстоянии более 200 мм после того, как зона реакции распространилась на начальное расстояние 30 мм.

Тест проводится с эталонным веществом. Затем испытание проводят по меньшей мере один раз с каждой смесью испытуемого вещества с целлюлозой.

Если обнаруживается, что максимальная скорость горения значительно превышает скорость горения эталонного вещества, испытание можно прекратить, в противном случае для трех смесей, показавших наибольшую скорость горения, испытание необходимо повторить пять раз.

2. ДАННЫЕ

По соображениям безопасности максимальную скорость горения, а не среднее значение, следует считать характерным окислительным свойством испытуемого вещества.

Для оценки имеет значение наибольшее значение скорости горения в серии из шести испытаний данной смеси.

Постройте график зависимости наибольшего значения скорости горения для каждой смеси от содержания окислителя.

Из графика возьмите максимальную скорость горения.

Шесть измеренных значений скорости горения в течение пробега, полученных для смеси с максимальной скоростью горения, не должны отличаться от среднего арифметического значения более чем на 10 %; в противном случае необходимо усовершенствовать методы измельчения и смешивания.

Полученную максимальную скорость горения сравнивают с максимальной скоростью горения эталонной смеси (см. 1.3).

3. ОТЧЕТ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет должен, если возможно, включать следующую информацию: - описание вещества, подлежащего испытанию;

- любая обработка испытуемого образца (например, измельчение, сушка и т. д.),

- результаты измерений,

- характер реакции (например, мгновенное горение на поверхности, горение всей массы, любая информация о продуктах сгорания, ...),

- все дополнительные замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, включая описание активности (пламенение, искрообразование, дымление, медленное тление и т. д.) и приблизительную продолжительность предварительного испытания на безопасность/проверочного испытания как для тестируемого, так и для эталонного вещества.

3.2. Интерпретация результата

Вещество считается окисляющим, если: (a) при предварительном испытании протекает бурная реакция;

(b) в ходе испытания максимальная скорость горения испытуемых смесей выше или равна максимальной скорости горения эталонной смеси целлюлозы и нитрата бария.

4. ССЫЛКИ

Никто.

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027397">

ЧАСТЬ B: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ

ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ: ЧАСТЬ B

А. ВВЕДЕНИЕ

См. Общее введение.

B. ОПРЕДЕЛЕНИЯ (i) Острая токсичность включает в себя побочные эффекты, возникающие в течение определенного времени (обычно 14 дней) после введения однократной дозы вещества.

(ii) LD50 (средняя смертельная доза) представляет собой статистически полученную разовую дозу вещества, которая, как можно ожидать, вызовет смерть у 50 % животных, получивших дозу. Значение LD50 выражается в весе тестируемого вещества на единицу веса подопытного животного (миллиграммы на килограмм).

(iii) LC50 (средняя летальная концентрация) представляет собой статистически полученную концентрацию вещества, которая, как ожидается, может вызвать смерть во время воздействия или в течение определенного времени после воздействия у 50 % животных, подвергшихся воздействию в течение определенного времени. Значение LC50 выражается как масса испытуемого вещества на стандартный объем воздуха (миллиграммы на литр).

(iv) Уровень отсутствия токсического воздействия – это максимальная доза или уровень воздействия, использованный в испытании, который не вызывает обнаруживаемых побочных эффектов.

(v) Подострая/субхроническая токсичность включает в себя побочные эффекты, возникающие у экспериментальных животных в результате многократного ежедневного введения или воздействия химического вещества в течение короткого периода их ожидаемой продолжительности жизни.

(vi) Максимально переносимая доза (MTD) – это самый высокий уровень дозы, вызывающий признаки токсичности, но не оказывающий существенного влияния на выживаемость по сравнению с тестом, в котором она используется, например в исследованиях канцерогенности из-за эффектов, отличных от опухолей.

(vii) Раздражение кожи – это возникновение обратимых воспалительных изменений в коже после нанесения тестируемого вещества.

(viii) Раздражение глаз – это возникновение обратимых изменений в глазу после нанесения тестируемого вещества на переднюю поверхность глаза.

(ix) Сенсибилизация кожи (аллергический контактный дерматит) представляет собой иммунологически вызываемую кожную реакцию на вещество.

C. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Существуют ограничения в степени, в которой результаты испытаний на животных и in vitro могут быть экстраполированы непосредственно на человека, и это необходимо иметь в виду при оценке и интерпретации испытаний.

Там, где они доступны, данные о людях считаются более важными для определения потенциального воздействия химического вещества на популяцию людей.

МУТАГЕННОСТЬ (включая предварительный тест на канцерогенность)

Для предварительной оценки мутагенного потенциала вещества необходимо получить информацию о двух категориях конечных точек: генной мутации и хромосомных аберрациях.

Эти две конечные точки оцениваются с помощью следующих тестов: (i) Тесты на образование генных (точечных) мутаций в прокариотических клетках, таких как Salmonella typhimurium; также приемлемы тесты с использованием Escherichia coli. Выбор между этими двумя тест-организмами может определяться природой тестируемого химического вещества.

(ii) Испытания по возникновению хромосомных аберраций в клетках млекопитающих, выращенных in vitro; также приемлема процедура in vivo (микроядерный тест или метафазный анализ клеток костного мозга).

D. ССЫЛКИ НА ЛИТЕРАТУРУ

Токсикология — развивающаяся экспериментальная наука, и по каждой теме существует множество литературы. Соответствующую информацию можно найти в Руководстве по тестированию ОЭСР.

Дополнительные замечания

Забота о животных

Строгий контроль условий окружающей среды и надлежащие методы ухода за животными имеют важное значение при проведении испытаний на токсичность. (i) Жилищные условия

Условия окружающей среды в помещениях или вольерах для экспериментальных животных должны соответствовать испытуемым видам. Для грызунов подходящими условиями являются комнатная температура 22 ± 3 °С и относительная влажность воздуха от 30 до 70 %; для кроликов и морских свинок температура должна быть 20 ± 3 °С при относительной влажности от 30 до 70 %.

Некоторые экспериментальные методы особенно чувствительны к температурным воздействиям, и в этих случаях подробности соответствующих условий включаются в описание метода испытаний. Во всех исследованиях токсических эффектов температуру и влажность следует контролировать, фиксировать и включать в окончательный отчет исследования.

При искусственном освещении последовательность обычно должна составлять 12 часов света и 12 часов темноты. Подробности режима освещения должны быть записаны и включены в окончательный отчет исследования.

В отчетах об экспериментах на животных важно указывать тип используемых клеток и количество животных, содержащихся в каждой клетке как во время воздействия химического вещества, так и в любой последующий период наблюдения.

(ii) Условия кормления

Рационы должны отвечать всем потребностям в питании исследуемых видов. Если тестируемые вещества вводятся животным в их рацион, их пищевая ценность может быть снижена из-за взаимодействия между веществом и компонентом рациона.

Возможность такой реакции следует учитывать при интерпретации результатов анализов.

Пищевые примеси, которые, как известно, влияют на токсичность, не должны присутствовать в мешающих концентрациях.

B. 1. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ПЕРОРАЛЬНАЯ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определения

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Испытуемое вещество вводят перорально через зонд в градуированных дозах нескольким группам экспериментальных животных, причем на каждую группу используют одну дозу. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных. Этот метод направлен, прежде всего, на исследования на видах грызунов.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых взрослых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. При необходимости испытуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем носителе. Рекомендуется, где это возможно, сначала рассмотреть возможность использования водного раствора, затем рассмотреть возможность применения раствора в растительном масле, а затем возможного раствора в других транспортных средствах или в суспензии. Для неводных транспортных средств соответствующие токсичные характеристики транспортного средства должны быть известны или должны быть определены до или во время испытания. У грызунов объем обычно не должен превышать 10 мл/кг массы тела, за исключением водных растворов, где можно использовать 20 мл/кг. Вариабельность исследуемого объема следует свести к минимуму путем корректировки концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы.

Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола диапазон изменения массы животных, используемых в испытании, не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

На каждом уровне дозы используют по меньшей мере 10 грызунов (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными.

1.6.2.3. Уровни доз

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. Данных должно быть достаточно для построения кривой «доза/реакция» и, где это возможно, для приемлемого определения LD50.

1.6.2.4. Предельный тест

Адекватную оценку острого перорального токсического потенциала для большинства целей получают, если в обработанной группе (пять животных каждого пола) в течение 14 дней после введения дозы 5 000 мг/кг не наблюдается смертности, связанной с соединением.

1.6.2.5. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Его следует определять по токсическим реакциям, скорости их возникновения и продолжительности периода восстановления; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, а также время смерти, особенно если существует тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3. Процедура

Перед введением вещества животные должны быть голодными. Для крыс пищу следует оставить на ночь; для животных с более высоким уровнем метаболизма подходит более короткий период голодания; вода не ограничена.

На следующий день животных следует взвесить, а затем испытуемое вещество вводить животным в виде одной дозы группами через зонд.

Если однократное введение невозможно, дозу можно вводить меньшими порциями в течение периода, не превышающего 24 часов. После введения вещества можно отказаться от еды еще на три-четыре часа. Если дозу вводят дробно в течение определенного периода, может оказаться необходимым обеспечить животных пищей и водой в зависимости от продолжительности периода. После введения проводят наблюдения и систематически регистрируют, индивидуальные записи следует вести для каждого животного. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня.

Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры, чтобы свести к минимуму потери животных для исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных. Наблюдения в клетках должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, а также соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделить наблюдению за тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее.

Животных, погибших во время испытания и выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, указав для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Индивидуальный вес животных следует определять и фиксировать незадолго до введения тестируемого вещества, затем еженедельно и в случае смерти. Изменения веса следует рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. LD50 можно определить признанным методом. Оценка данных должна включать взаимосвязь, если таковая имеется, между воздействием на животных испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсикологические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний,

- уровни доз (в зависимости от носителя, если он используется, и концентрации),

- табулирование данных реакции по полу и уровню дозы (т.е. количество умерших животных, количество животных с признаками токсичности, количество животных, подвергшихся воздействию),

- время смерти после введения дозы,

- клеточные наблюдения,

- значение ЛД50 для каждого пола, определенное через 14 дней (с указанием метода определения),

- 95 % доверительный интервал для LD50,

- кривая дозы/смертности и наклон (если это допускается методом определения),

- результаты вскрытия,

- любые гистопатологические находки,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 2. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ВДЫХАНИЕ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определения

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Несколько групп экспериментальных животных в течение определенного периода времени подвергаются воздействию испытуемого вещества в градуированных концентрациях, при этом на группу используется одна концентрация. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют на необходимое количество групп. Их не обязательно подвергать моделируемому воздействию, если только это не указано в типе используемого оборудования для воздействия.

При необходимости к испытуемому веществу можно добавить подходящий носитель, чтобы обеспечить соответствующую концентрацию испытуемого вещества в атмосфере, после чего следует использовать контрольную группу транспортного средства. Если для облегчения дозирования используются носитель или другие добавки, следует знать, что они не оказывают токсического действия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола изменение массы животных, используемых в испытаниях, не должно превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня концентрации используют не менее 10 грызунов (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными.

1.6.2.3. Концентрации воздействия

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. Данных должно быть достаточно для построения концентрационной кривой смертности и, где это возможно, для приемлемого определения ЛК50.

1.6.2.4. Предельный тест

Если воздействие на пять подопытных животных-самцов и пяти самок 20 мг на литр газа или 5 мг на литр аэрозоля или твердых частиц в течение четырех часов (или, если это невозможно из-за физических или химических, в том числе взрывоопасных , свойства испытуемого вещества, максимально достижимая концентрация) не приводит к смертности, связанной с соединением, в течение 14 дней, дальнейшее тестирование может не считаться необходимым.

1.6.2.5. Время контакта

Минимальный период воздействия должен составлять четыре часа.

1.6.2.6. Оборудование

Животных следует тестировать с помощью ингаляционного оборудования, рассчитанного на поддержание динамического потока воздуха со скоростью не менее 12 воздухообменов в час, чтобы обеспечить адекватное содержание кислорода и равномерное распределение атмосферы воздействия. Если используется камера, ее конструкция должна сводить к минимуму скопление подопытных животных и максимизировать воздействие на них испытуемого вещества при вдыхании. Как правило, для обеспечения стабильности атмосферы камеры общий «объем» подопытных животных не должен превышать 5 % объема испытательной камеры. Можно использовать оро-назальную экспозицию, облучение только головы или всего тела в отдельной камере; первые два помогут свести к минимуму попадание тестируемого вещества другими путями.

1.6.2.7. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдений не должна быть жестко фиксирована. Его следует определять по токсическим реакциям, скорости их возникновения и продолжительности периода восстановления; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, а также время смерти, особенно если существует тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3. Процедура

Незадолго до воздействия животных взвешивают, а затем подвергают воздействию тестируемой концентрации в назначенном аппарате в течение как минимум четырех часов после уравновешивания концентрации в камере. Время для уравновешивания должно быть коротким. Температура, при которой проводится испытание, должна поддерживаться на уровне 22 ± 3 °С. В идеале относительная влажность должна поддерживаться в пределах от 30 % до 70 %, но в некоторых случаях (например, при испытаниях аэрозолей) это может оказаться невозможным. Во время воздействия следует воздерживаться от еды и воды. Следует использовать динамическую систему ингаляции с подходящей аналитической системой контроля концентрации. Для установления подходящих концентраций воздействия рекомендуется провести пробное испытание. Система должна обеспечивать максимально быстрое достижение стабильных условий воздействия. Скорость воздушного потока должна быть отрегулирована так, чтобы условия во всей камере воздействия были однородными.

Измерения или мониторинг следует производить: (а) скорости воздушного потока (постоянно);

(b) фактической концентрации испытуемого вещества, измеренной в зоне дыхания. В течение периода воздействия концентрация не должна изменяться более чем на ± 15 % от среднего значения. Однако в случае пыли и некоторых аэрозолей такой уровень контроля может оказаться недостижимым, и тогда будет приемлемым более широкий диапазон. Анализ твердых частиц и аэрозолей следует проводить по мере необходимости, по крайней мере один раз, для определения распределения частиц по размерам.

(в) температуры и влажности,

(d) во время и после воздействия; наблюдения производятся и фиксируются систематически; Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня. Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры, чтобы свести к минимуму потери животных для исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных.

Наблюдения в клетках должны включать изменения кожи и шерсти, глаз, слизистых оболочек, дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, а также соматомоторной активности и поведения. Особое внимание следует уделить наблюдению за дыхательным поведением, тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее. Индивидуальный вес животных следует определять еженедельно после заражения и в момент смерти.

Животных, погибших во время испытания, и животных, выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию с особым вниманием к любым изменениям в верхних и нижних дыхательных путях. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

2. ДАННЫЕ

Данные должны быть обобщены в табличной форме, показывающей для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Изменения веса необходимо рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. LC50 следует определять признанным методом. Оценка данных должна включать взаимосвязь, если таковая имеется, между воздействием на животное испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний:

Описание устройства для воздействия, включая конструкцию, тип, размеры, источник воздуха, систему генерации частиц и аэрозолей, метод кондиционирования воздуха и метод содержания животных в испытательной камере, когда он используется. Должно быть описано оборудование для измерения температуры, влажности, концентрации и размера аэрозольных частиц.

Данные о воздействии

Они должны быть сведены в таблицу и представлены со средними значениями и мерой изменчивости (например, стандартное отклонение) и должны, если возможно, включать: (a) скорости потока воздуха через ингаляционное оборудование;

б) температура и влажность воздуха;

(c) номинальные концентрации (общее количество испытуемого вещества, подаваемого в ингаляционное оборудование, деленное на объем воздуха);

(d) характер транспортного средства, если оно используется;

(д) фактические концентрации в зоне тестового дыхания;

(f) средние размеры частиц;

(g) период равновесия;

(h) период воздействия;

- табулирование данных реакции по полу и уровню воздействия (т. е. количество умерших животных; количество животных с признаками токсичности; количество животных, подвергшихся воздействию),

- время смерти во время или после воздействия,

- клеточные наблюдения,

- LC50 для каждого пола, определяемый в конце периода наблюдения (с указанием метода расчета),

- 95 % доверительный интервал для LC50,

- кривая дозы/смертности и наклон (если это допускается методом определения),

- результаты вскрытия,

- любые гистопатологические находки,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 3. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (КОЖНАЯ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Испытуемое вещество наносят на кожу градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных, по одной дозе на группу. Впоследствии производятся наблюдения за последствиями и смертями. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных клетках в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых взрослых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. Примерно за 24 часа до исследования шерсть на дорсальной части туловища животных следует удалить путем стрижки или бритья. При стрижке или бритье шерсти необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу, что может привести к изменению ее проницаемости. Не менее 10 % поверхности тела должно быть свободным для нанесения испытуемого вещества. При испытании твердых веществ, которые при необходимости можно измельчить в порошок, испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании носителя следует учитывать влияние носителя на проникновение испытуемого вещества в кожу. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Можно использовать взрослую крысу или кролика. Могут использоваться и другие виды, но их использование потребует обоснования. Следует использовать широко используемые лабораторные штаммы. Для каждого пола диапазон изменения массы животных, используемых в испытании, не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов) со здоровой неповрежденной кожей. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Использование меньшего количества животных иногда может быть оправдано, особенно в случае кроликов.

1.6.2.3. Уровни доз

Их должно быть достаточно, по крайней мере, три, и они должны быть расположены на соответствующем расстоянии друг от друга, чтобы создать тестовые группы с различными токсическим эффектом и уровнем смертности. При принятии решения об уровне дозы следует учитывать любые раздражающие или разъедающие эффекты. Данных должно быть достаточно для построения кривой «доза/реакция» и, где это возможно, для приемлемого определения LD50.

1.6.2.4. Предельный тест

Если в предварительном тесте доза 2000 мг/кг или более, нанесенная на неповрежденную кожу по меньшей мере пяти животных каждого пола, не приводит к смертности, связанной с соединением, в течение 14 дней, дальнейшее тестирование на других уровнях дозы не может рассматриваться. необходимый.

1.6.2.5. Период наблюдения

Срок наблюдения должен составлять не менее 14 дней. Однако продолжительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Его следует определять по токсическим реакциям, скорости их возникновения и продолжительности периода восстановления; таким образом, он может быть продлен, если это будет сочтено необходимым. Важное значение имеет время появления и исчезновения признаков токсичности, их продолжительность и время наступления смерти, особенно если имеется тенденция к отсрочке смерти.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Испытуемое вещество следует наносить равномерно на площадь, составляющую примерно 10 % общей площади поверхности тела. В случае высокотоксичных веществ площадь покрытия может быть меньше, но большая часть площади должна быть покрыта как можно более тонким и равномерным слоем.

Исследуемые вещества следует удерживать в контакте с кожей с помощью пористой марлевой повязки и нераздражающей ленты в течение 24 часов. Место проведения испытаний должно быть дополнительно накрыто соответствующим образом, чтобы сохранить марлевую повязку и испытуемое вещество и гарантировать, что животные не смогут проглотить испытуемое вещество. Для предотвращения проглатывания тестируемого вещества можно использовать ограничители, но полная иммобилизация не является рекомендуемым методом.

В конце периода воздействия остатки испытуемого вещества следует удалить, если это практически возможно, с помощью воды или другого подходящего метода очистки кожи.

Наблюдения следует систематически фиксировать по мере их проведения. Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. Наблюдения следует проводить часто в течение первого дня. Тщательное клиническое обследование следует проводить не реже одного раза в рабочий день, другие наблюдения следует проводить ежедневно и принимать соответствующие меры, чтобы свести к минимуму потери животных для исследования, например, вскрытие или охлаждение животных, найденных мертвыми, а также изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных.

Наблюдения в клетках должны включать изменения в шерсти, обработанной коже, глазах и слизистых оболочках, а также в дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной системах, а также соматомоторной активности и характере поведения. Особое внимание следует уделить наблюдениям за тремором, судорогами, слюнотечением, диареей, летаргией, сном и комой. Время смерти должно быть зафиксировано как можно точнее. Животных, погибших во время испытания и выживших по окончании испытания, подвергают вскрытию. Все грубые патологические изменения должны быть зафиксированы. При наличии показаний ткани следует взять на гистопатологическое исследование.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, указав для каждой испытуемой группы количество животных в начале испытания, время гибели отдельных животных, количество животных, проявляющих другие признаки токсичности, описание токсических эффектов и результаты вскрытия. Индивидуальный вес животных следует определять и фиксировать незадолго до применения тестируемого вещества, затем еженедельно и в момент смерти; изменения веса следует рассчитывать и фиксировать, если выживаемость превышает один день. LD50 следует определять признанным методом.

Оценка данных должна включать оценку взаимосвязей, если таковые имеются, между воздействием на животное испытуемого вещества и частотой и тяжестью всех отклонений, включая поведенческие и клинические отклонения, грубые поражения, изменения массы тела, смертность и любые другие токсикологические эффекты.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний (включая способ очистки кожи),

- уровни доз (в зависимости от носителя, если он используется, и концентрации),

- табулирование данных реакции по полу и уровню дозы (т.е. количество умерших животных; количество животных с признаками токсичности; количество животных, подвергшихся воздействию),

- время смерти после введения дозы,

- клеточные наблюдения,

- Значение LD50 для каждого пола, определенное через 14 дней с использованием указанного метода определения,

- 95 % доверительный интервал для LD50 (если это возможно),

- кривая дозы/смертности и наклон, если это допускается методом определения,

- результаты вскрытия,

- любые гистопатологические находки,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 4. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ РАЗДРАЖЕНИЕ КОЖИ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Испытуемое вещество наносят однократно на кожу нескольких экспериментальных животных, причем каждое животное служит своим контролем. Степень раздражения считывается и оценивается через определенный интервал, а затем описывается для полной оценки эффектов. Продолжительность наблюдений должна быть достаточной, чтобы полностью оценить обратимость наблюдаемых эффектов.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Примерно за 24 часа до тестирования следует удалить шерсть со спинной части туловища животного путем стрижки или бритья.

При стрижке или бритье шерсти следует соблюдать осторожность, чтобы не поцарапать кожу. Следует использовать только животных со здоровой неповрежденной кожей.

При испытании твердых веществ (которые при необходимости можно измельчить в порошок) испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании транспортных средств следует учитывать влияние транспортного средства на раздражение кожи испытуемым веществом. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными.

Испытуемые вещества, которые являются сильнокислотными или щелочными, не нуждаются в проверке на первичное раздражение кожи из-за их предсказуемых разъедающих свойств. Тестирование материалов, которые оказались очень токсичными при попадании через кожу, может оказаться ненужным.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Хотя можно использовать несколько видов млекопитающих, предпочтительным видом является кролик-альбинос.

1.6.2.2. Количество животных

Используют не менее трех здоровых взрослых животных. Для уточнения двусмысленных ответов могут потребоваться дополнительные животные.

1.6.2.3. Уровень дозы

При отсутствии противопоказаний на место исследования наносят 0,5 мл жидкости или 0,5 г твердого или полутвердого вещества. Для необработанной контрольной группы отдельные животные не требуются. Соседние участки необработанной кожи каждого животного служат контролем в тесте.

1.6.2.4. Период наблюдения

Продолжительность периода наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Этого должно быть достаточно, чтобы полностью оценить обратимость или необратимость наблюдаемых эффектов, но обычно не требуется более 14 дней после применения.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Тестируемое вещество следует нанести на небольшой участок кожи (около 6 см2) и накрыть марлевым пластырем, который удерживается нераздражающей лентой. В случае жидкостей или некоторых паст может оказаться необходимым нанести испытуемое вещество на марлевый пластырь, а затем нанести его на кожу. Пластырь должен свободно прилегать к коже с помощью подходящей полуокклюзионной повязки на протяжении всего периода воздействия. Однако в некоторых случаях использование окклюзионной повязки можно считать целесообразным. Следует предотвратить доступ животного к пластырю и последующее проглатывание/вдыхание тестируемого вещества.

Продолжительность воздействия четыре часа. Если есть подозрение, что вещество может вызвать тяжелую кожную реакцию (т. е. быть разъедающим), продолжительность воздействия следует сократить (например, до одного часа или трех минут).

Если используется период воздействия менее четырех часов и наблюдается серьезная кожная реакция, нет необходимости повторять эксперимент с использованием четырехчасового периода воздействия. Более длительная экспозиция может быть показана при определенных условиях, например. ожидаемый характер использования и воздействия на человека. В конце периода воздействия остаточное испытуемое вещество следует удалить, если это практически возможно, с использованием воды или соответствующего растворителя, не изменяя существующую реакцию или целостность эпидермиса. 1.6.3.1. Наблюдение и оценка

За животными следует наблюдать на предмет появления признаков эритемы и отека, а реакция оценивается через 30–60 минут, а затем через 24, 48 и 72 часа после удаления пластыря. Раздражение кожи классифицируют и регистрируют в соответствии с системой, приведенной в таблице 1. При необходимости могут потребоваться дальнейшие наблюдения для установления обратимости. Помимо наблюдения за раздражением, необходимо подробно описать любые серьезные поражения, такие как коррозия (необратимое разрушение тканей кожи) и другие токсические эффекты.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого отдельного животного степень раздражения эритемы и отека на протяжении всего периода наблюдения. Следует фиксировать любые серьезные повреждения, описание степени и характера раздражения, обратимости или коррозии, а также любого другого наблюдаемого токсического эффекта.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний (включая соответствующие физико-химические свойства химического вещества, а также методику подготовки и очистки кожи),

- табулирование данных реакции раздражения для каждого отдельного животного для каждого периода наблюдения (например, 1, 24, 48 и 72 часа и т. д. после удаления пластыря),

- описание любых обнаруженных серьезных повреждений, включая коррозию,

- описание степени и характера наблюдаемого раздражения и любых гистопатологических данных,

- описание любых токсических эффектов, кроме раздражения кожи,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

ТАБЛИЦА ПРИЛОЖЕНИЯ: СТЕПЕНЬ КОЖНОЙ РЕАКЦИИ

>PIC-ФАЙЛ="T0027398">

B. 5. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ РАЗДРАЖЕНИЕ ГЛАЗ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто

1.4. Принцип метода испытаний

Исследуемое вещество наносят в однократной дозе на один из глаз каждому из нескольких экспериментальных животных; необработанный глаз используется для предоставления контрольной информации. Степень раздражения оценивается и классифицируется через определенные промежутки времени и далее описывается для обеспечения полной оценки эффектов. Продолжительность наблюдений должна быть достаточной, чтобы полностью оценить обратимость или необратимость наблюдаемых эффектов.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Оба глаза каждого экспериментального животного, предварительно отобранного для тестирования, должны быть осмотрены в течение 24 часов до начала тестирования. Не следует использовать животных с раздражением глаз, дефектами глаз или уже имеющимся повреждением роговицы. Сильнощелочные или кислотные испытуемые вещества, а также вещества, которые продемонстрировали определенную коррозионную активность в исследовании раздражения кожи или в других испытаниях, не подлежат тестированию на раздражение глаз.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Хотя использовались различные экспериментальные животные, рекомендуется проводить тестирование на здоровых взрослых кроликах-альбиносах.

1.6.2.2. Количество животных

Необходимо использовать как минимум трех животных. Для уточнения двусмысленных ответов могут потребоваться дополнительные животные.

1.6.2.3. Уровень дозы

Для тестирования жидкостей используют дозу 0,1 мл. При тестировании твердых, пастообразных и твердых веществ используемое количество должно иметь объем 0,1 мл или вес примерно 0,1 г (вес всегда должен записываться). Если испытуемый материал твердый или гранулированный, его следует измельчить до мелкой пыли. Объем частиц следует измерять после их осторожного уплотнения, например постукивая по мерному контейнеру.

1.6.2.4. Период наблюдения

Продолжительность периода наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Этого должно быть достаточно для оценки обратимости или необратимости наблюдаемых эффектов, но обычно не требуется более 21 дня после закапывания.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Тестируемое вещество следует поместить в конъюнктивальный мешок одного глаза каждого животного, осторожно оттянув нижнее веко от глазного яблока. Затем крышки осторожно удерживают вместе в течение примерно одной секунды, чтобы предотвратить потерю материала. Другой глаз, который остается необработанным, служит контролем.

Глаза подопытных животных не следует промывать в течение 24 часов после закапывания тестируемого вещества. Если это будет сочтено целесообразным, через 24 часа можно использовать промывание.

Для веществ, оказывающих раздражающее действие в результате этого испытания, может быть проверена ценность промывания глаз как средства уменьшения раздражающего или другого повреждающего воздействия. В этих случаях рекомендуется использовать шесть кроликов. Через четыре секунды после закапывания тестируемого вещества промывают глаза трех кроликов и через 30 секунд после закапывания тестируемого вещества промывают глаза трех других кроликов. В обеих группах глаза промывают в течение пяти минут с использованием объема и скорости потока, не вызывающих травм. 1.6.3.1. Наблюдение и оценка

Глаза следует осматривать через 1, 24, 48 и 72 часа. Если через 72 часа нет признаков раздражения, исследование можно прекратить.

Расширенное наблюдение может быть необходимо, если наблюдается стойкое поражение роговицы или другое раздражение глаз, чтобы определить прогресс поражений и их обратимость или необратимость. В дополнение к наблюдениям за роговицей, радужной оболочкой и конъюнктивой следует регистрировать и сообщать о любых других выявленных поражениях. При каждом осмотре следует фиксировать степень глазной реакции (таблица). (Оценка реакции глаз может интерпретироваться по-разному. В помощь испытательным лабораториям и лицам, участвующим в проведении и интерпретации наблюдений, можно использовать иллюстрированное руководство по раздражению глаз.)

Исследование реакций можно облегчить с помощью бинокулярной лупы, ручной щелевой лампы, биомикроскопа или другого подходящего устройства. После записи наблюдений через 24 часа глаза любого или всех кроликов можно дополнительно обследовать с помощью флуоресцеина.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого отдельного животного степень раздражения в назначенное время наблюдения. Необходимо сообщить описание степени и характера раздражения, наличия серьезных поражений и любых наблюдавшихся эффектов, кроме глазных.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, по возможности, включать следующую информацию: - данные о животных (вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.),

- условия испытаний (включая соответствующие физико-химические свойства испытуемого вещества),

- табулирование данных о раздражающей/разъедающей реакции для каждого отдельного животного в каждый момент времени наблюдения (например, 1, 24, 48 и 72 часа),

- описание любых обнаруженных серьезных поражений,

- описательное описание степени и характера наблюдаемого раздражения или коррозии, включая обратимость,

- описание метода, используемого для оценки раздражения через 1, 24, 48 и 72 часа (например, ручная щелевая лампа, биомикроскоп, флуоресцеин),

- описание любых отмеченных неглазных местных эффектов,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

ТАБЛИЦА ПРИЛОЖЕНИЯ: СТАДИЯ ПОРАЖЕНИЙ ГЛАЗ

>PIC-ФАЙЛ="T0027399">

Б. 6. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ КОЖНАЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний/Тест максимизации на морских свинках

После первоначального воздействия тестируемого вещества (период «индукции») животных подвергают через две недели после последнего индукционного воздействия «пробному» воздействию тестируемого вещества, чтобы установить, было ли вызвано состояние гиперчувствительности. Сенсибилизацию определяют путем изучения реакции кожи на воздействие возбудителя.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Здоровых молодых животных (менее одного года) рандомизируют и распределяют в экспериментальную и контрольную группы. Перед введением дозы волосы удаляют путем стрижки или бритья в области плеч. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Используется морская свинка-альбинос.

1.6.2.2. Число и пол

Могут быть использованы самцы и/или самки животных. Если используются самки, они должны быть нерожавшими и небеременными. В экспериментальной группе используют 20 животных и, по меньшей мере, 10 в контрольной группе. Использование меньшего количества животных должно быть оправдано.

1.6.2.3. Уровни доз

Концентрация тестируемого вещества доводится до максимально допустимого уровня на каждом этапе индукции.

Провокационная концентрация не должна вызывать раздражения кожи у несенсибилизированных животных. Эти концентрации могут быть определены в ходе небольшого пилотного исследования (два-три животных).

1.6.2.4. Период наблюдения

Во время индукционного периода проводятся наблюдения за кожей на предмет возможного раздражения. После воздействия заражения кожные реакции регистрируют через 48 и 72 часа.

1.6.3. Процедура

Животных взвешивают перед началом испытания и в конце испытания. Плечевая область очищается от волос. Процедура состоит из двух этапов: 1.6.3.1. Индукция

День 0 – обработанная группа

Следующие пары внутрикожных инъекций вводятся в область плеч так, чтобы по одной из каждой пары располагались с каждой стороны от средней линии.

1. 0,1 мл полный адъювант Фрейнда (FCA),

2. 0,1 мл испытуемого вещества, при необходимости в транспортном средстве,

3. 0,1 мл исследуемого вещества в FCA.

Инъекции 1 и 2 вводятся близко друг к другу и ближе к голове, а 3 — в каудальную часть тестовой зоны.

День 0 – контрольная группа

Следующие пары внутрикожных инъекций проводятся в те же места, что и выше. 1. 0,1 мл ФСА,

2. Только носитель 0,1 мл,

3. Раствор 0,1 мл на FCA,

День 7 – обработанная группа

Тестируемая зона снова очищается от волос. Тестируемые вещества в подходящем носителе (при необходимости можно наносить непосредственно жидкости) распределяют по фильтровальной бумаге, наносят на исследуемую область и удерживают в контакте с подходящей повязкой в ​​течение 48 часов.

День 7 – контрольная группа

Тестируемая зона снова очищается от волос. Только транспортное средство наносится аналогичным образом на испытательную зону и удерживается в контакте с помощью подходящей повязки в течение 48 часов.

1.6.3.2. Испытание

День 21

Бока обработанных и контрольных животных очищают от шерсти. Пластырь или камеру, содержащую тестируемое вещество, накладывают на левый бок обработанных животных, а пластырь или камеру с носителем только на правый бок.

Пластыри удерживаются в контакте с помощью подходящей повязки в течение 24 часов.

Контрольная группа подвергается такому же воздействию.

День 23 и 24 – через 21 час после снятия пластыря проблемную зону очищают и при необходимости бреют.

- через три часа (через 48 часов от начала заражения) наблюдают и регистрируют кожную реакцию,

- Через 24 часа после этого наблюдения проводят и записывают второе наблюдение (72 часа).

Для уточнения результатов, полученных в первой пробе, вторую пробу, если необходимо, с новой контрольной группой транспортного средства, следует рассмотреть примерно через неделю после первой.

1.6.3.3. Наблюдение и оценка

Все кожные реакции и любые необычные результаты, возникшие в результате процедур индукции и заражения, следует фиксировать и сообщать.

2. ДАННЫЕ

Данные следует обобщить в табличной форме, показывая для каждого животного кожные реакции при каждом наблюдении.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен, по возможности, содержать следующую информацию: - использованная линия морской свинки,

- условия испытаний,

- количество, возраст и пол животных,

- индивидуальный вес животных в начале и в конце испытания,

- каждое наблюдение, сделанное на каждом животном, включая систему оценок, если она используется,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Примечания

Максимизационный тест на морских свинках (GPMT) представляет собой широко используемый тест адъювантного типа. Хотя для выявления способности вещества провоцировать кожную сенсибилизирующую реакцию можно использовать несколько других методов, перечисленных в Приложении, предпочтительным (эталонным) методом считается GPMT. Его чувствительность и способность обнаруживать потенциальные сенсибилизаторы кожи человека считаются важными в системе классификации токсичности, имеющей отношение к общественному здравоохранению. Выбор любого альтернативного теста должен определяться критериями, гарантирующими его валидность. Среди этих критериев - ожидаемая реакция на стандартные аллергены, такие как 2,4-динитрохлорбензол или п-фенилендиамин или другой сильный сенсибилизатор, соответствующий классу тестируемого вещества.

Не существует единого метода испытаний, который бы адекватно идентифицировал все вещества, способные вызывать сенсибилизацию кожи человека, и который был бы применим ко всем веществам.

При выборе теста необходимо учитывать такие факторы, как физические характеристики вещества, включая его способность проникать через кожу, и способ его контакта с людьми, которые могут подвергнуться воздействию. Тесты с использованием морских свинок можно подразделить на тесты адъювантного типа, в которых аллергическое состояние усиливается путем растворения или суспендирования тестируемого вещества в полном адъюванте Фрейнда (FCA), и неадъювантные тесты. В некоторых случаях могут быть веские причины для выбора теста, включающего местное применение, а не внутрикожную инъекцию, используемую в тесте максимизации на морских свинках. Соображения снова будут включать физические характеристики испытуемого вещества и условия вероятного воздействия на человека.

Независимо от используемого метода чувствительность штамма морских свинок, используемого для тестирования кожной сенсибилизации, должна проверяться через регулярные промежутки времени (шесть месяцев) с использованием известных сильных и умеренных сенсибилизаторов и при достаточном количестве полученных положительных ответов.

Приложение

>ФАЙЛ ПИК="T0027400">

B. 7. ПОДОКРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ПЕРОРАЛЬНАЯ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определения

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Исследуемое вещество вводят перорально, ежедневно, градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных по одной дозе на группу в течение 28 дней. В период введения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют по группам лечения. Тестируемые вещества можно вводить с пищей, через зонд, в капсулах или с питьевой водой. Всем животным следует вводить дозы одним и тем же методом в течение всего экспериментального периода. Если для облегчения дозирования используются носитель или другие добавки, следует знать, что они не оказывают токсического действия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых животных, и в идеале введение препарата следует начинать до того, как крысам исполнится шесть недель, и в любом случае не старше восьми недель. В начале исследования изменение веса используемых животных не должно превышать ± 20 % от среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, количество животных следует увеличить на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно лечить высокими дозами в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным появлением токсических эффектов в течение 14 дней после лечения.

1.6.2.3. Уровни доз

Следует использовать как минимум три уровня дозы и контроль. За исключением обработки испытуемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с субъектами испытуемой группы. Если для облегчения дозирования используется носитель, контрольной группе следует вводить носитель таким же образом, как и группам, получавшим лечение, и получать такое же количество носителя, как и группа с самым высоким уровнем дозы. Самый высокий уровень дозы должен приводить к токсическим эффектам, но приводить к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать каких-либо признаков токсичности. Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать этот уровень. В идеале средний уровень дозы должен вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной дозы, уровни доз должны быть разнесены так, чтобы обеспечить градацию токсических эффектов. В группах с низким и средним уровнем смертности, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

Когда испытуемое вещество вводят в рацион, можно использовать либо постоянную пищевую концентрацию (млн или мг/кг пищи), либо постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного; должна быть указана используемая альтернатива. Для вещества, вводимого через зонд, дозу следует вводить в одно и то же время каждый день, а уровень дозы следует корректировать через определенные промежутки времени (еженедельно или раз в две недели), чтобы поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного.

1.6.2.4. Предельный тест

Если 28-дневное исследование, проведенное в соответствии с методом, подробно описанным ниже, при одном уровне дозы 1000 мг/кг массы тела в день или более высоком уровне дозы, связанном с возможным воздействием на человека, если это известно, не дает доказательств токсического воздействия , дальнейшее тестирование может не считаться необходимым. Для веществ с низкой токсичностью важно гарантировать, что при введении их в пищу количества и другие свойства исследуемого вещества не мешают нормальным потребностям в питании.

1.6.2.5. Период наблюдения

За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время их начала, степень и продолжительность. Следует фиксировать время смерти и время появления и исчезновения признаков токсичности.

1.6.3. Процедура

Животным в идеале вводят тестируемое вещество семь дней в неделю в течение 28 дней. Животных в любой вспомогательной группе, запланированной для последующего наблюдения, следует содержать в течение следующих 14 дней без лечения для выявления выздоровления или сохранения токсических эффектов.

Наблюдения в клетках должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Еженедельно следует проводить измерения потребления пищи (и потребления воды, когда тестируемое вещество вводится с питьевой водой) и еженедельно взвешивать животных.

Регулярное наблюдение за животными необходимо для того, чтобы гарантировать, что животные, насколько это возможно, не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных следует удалять и подвергать вскрытию, если их заметили.

В конце периода испытаний для всех животных, включая контрольную группу, необходимо провести следующее обследование: 1. гематологическое исследование, включая, по крайней мере, гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов, а также измерение потенциала свертывания крови;

2. клиническая биохимия крови, включающая по крайней мере один параметр функции печени и почек: аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамат-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий билирубин. и общий сывороточный белок.

Другие определения, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, глюкозу натощак, анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина, активности холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых эффектов. 1.6.3.1. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. Печень, почки, надпочечники и яички следует взвешивать влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани (печень, почки, селезенка, надпочечники и сердце, а также любые органы с грубыми поражениями или изменениями размеров) следует сохранить в подходящей среде для возможного будущего гистопатологического исследования.

1.6.3.2. Гистопатологическое исследование

В группе высоких доз и в контрольной группе гистологическое исследование следует проводить на сохранившихся органах и тканях. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в любой вспомогательной группе следует исследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний,

- уровни доз (включая носитель, если он используется) и концентрации,

- данные о токсической реакции с разбивкой по полу и дозе,

- уровень отсутствия эффекта, если это возможно,

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до завершения,

- токсическое или иное воздействие,

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующего течения,

- данные о еде и весе тела,

- проведенные гематологические тесты и все результаты,

- проведенные клинические биохимические тесты и все результаты,

- результаты вскрытия,

- подробное описание всех гистопатологических результатов,

- статистическая обработка результатов, где это необходимо,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 8. ПОДОКРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ВДЫХАНИЕ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Несколько групп экспериментальных животных ежедневно в течение определенного периода времени подвергаются воздействию тестируемого вещества в градуированных концентрациях, при этом на группу используется одна концентрация в течение 28 дней. Если транспортное средство используется для создания соответствующей концентрации испытуемого вещества в атмосфере, следует использовать контрольную группу транспортного средства. В период введения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления не менее пяти дней до эксперимента. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют на необходимое количество групп. При необходимости к испытуемому веществу можно добавить подходящий носитель, чтобы обеспечить соответствующую концентрацию вещества в атмосфере. Если для облегчения дозирования используется носитель или другая добавка, следует знать, что они не оказывают токсического воздействия. При необходимости можно использовать исторические данные.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Если нет противопоказаний, предпочтительным видом являются крысы. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых животных.

В начале исследования диапазон изменения веса используемых животных не должен превышать ± 20 % соответствующего среднего значения.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждой тестовой группы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, их количество должно быть увеличено на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно обрабатывать высоким уровнем концентрации в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным появлением токсических эффектов в течение 14 дней после обработки.

1.6.2.3. Концентрация воздействия

Требуется как минимум три концентрации: контроль или контроль транспортного средства (соответствует концентрации транспортного средства на самом высоком уровне), если используется транспортное средство. За исключением обработки испытуемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с животными испытуемой группы. Самая высокая концентрация должна приводить к токсическим эффектам, но к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самая низкая концентрация не должна вызывать каких-либо признаков токсичности. Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, минимальная концентрация должна превышать это значение. В идеале промежуточная концентрация должна вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной концентрации, концентрации следует распределять так, чтобы обеспечить градацию токсического воздействия. В группах с низким и средним уровнем смертности, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

1.6.2.4 Время воздействия

Продолжительность ежедневного воздействия должна составлять шесть часов, но могут потребоваться и другие периоды для удовлетворения особых требований.

1.6.2.5. Оборудование

Животных следует тестировать в ингаляционном оборудовании, предназначенном для поддержания динамического потока воздуха с частотой не менее 12 воздухообменов в час, чтобы обеспечить адекватное содержание кислорода и равномерное распределение атмосферы воздействия. Если используется камера, ее конструкция должна свести к минимуму скопление подопытных животных и максимально увеличить воздействие на них вдыхания тестируемого вещества. Как правило, для обеспечения стабильности атмосферы камеры общий «объем» подопытных животных не должен превышать 5 % объема испытательной камеры. Можно использовать оро-назальную экспозицию, экспозицию только головы или индивидуальную экспозицию камеры всего тела; первые два сведут к минимуму использование других маршрутов.

1.6.2.6. Период наблюдения

Экспериментальных животных следует ежедневно наблюдать на предмет признаков токсичности в течение всего периода лечения и восстановления. Следует фиксировать время смерти и время появления и исчезновения признаков токсичности.

1.6.3. Процедура

Животных подвергают воздействию тестируемого вещества ежедневно, пять-семь дней в неделю, в течение 28 дней. Животные в любых вспомогательных группах, запланированных для последующего наблюдения, должны содержаться в течение следующих 14 дней без лечения для выявления восстановления или сохранения токсических эффектов. Температура, при которой проводится испытание, должна поддерживаться на уровне 22 ± 3 °С.

В идеале относительная влажность должна поддерживаться в пределах от 30 до 70 %, но в некоторых случаях (например, при испытаниях аэрозолей) это может оказаться невозможным. Во время воздействия следует воздерживаться от еды и воды.

Следует использовать динамическую систему ингаляции с подходящей аналитической системой контроля концентрации. Для установления подходящих концентраций воздействия рекомендуется провести пробное испытание. Поток воздуха следует отрегулировать так, чтобы условия во всей камере воздействия были однородными. Система должна обеспечивать максимально быстрое достижение стабильных условий воздействия.

Измерения или мониторинг следует проводить: (a) скорости воздушного потока (постоянно);

(b) фактической концентрации испытуемого вещества, измеренной в зоне дыхания. В течение периода ежедневного воздействия концентрация не должна изменяться более чем на ± 15 % от среднего значения. Однако в случае пыли и аэрозолей такой уровень контроля может оказаться недостижимым, и тогда будет приемлемым более широкий диапазон. В течение всего исследования ежедневные концентрации следует поддерживать настолько постоянными, насколько это практически возможно. Для твердых частиц и аэрозолей, чтобы оценить постоянство распределения частиц по размерам, измерение последних следует проводить так часто, как это необходимо;

(c) температуры и влажности;

(d) во время и после воздействия; наблюдения производятся и фиксируются систематически; Для каждого животного следует вести индивидуальный учет. За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время начала, их степень и продолжительность. Наблюдения в клетках должны включать изменения кожи и шерсти, глаз, слизистых оболочек, дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Измерения веса животных следует проводить еженедельно. Также рекомендуется еженедельно измерять потребление пищи. Необходимо регулярное наблюдение за животными, чтобы гарантировать, что животные не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных следует удалять и подвергать вскрытию, если их заметили.

В конце испытания на всех животных, включая контрольную, должны быть проведены следующие исследования: (i) гематологические исследования, включая, по крайней мере, гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов и показатель свертываемости крови;

(ii) клинические биохимические показатели крови, включая по крайней мере один параметр функции печени и почек: сывороточная аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамат-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови , общий билирубин и общий белок сыворотки.

Другие определения, которые могут быть необходимы для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, анализ глюкозы натощак, липиды, гормоны, кислотно-щелочной баланс, метгемоглобин и активность холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых токсических эффектов. 1.6.3.1. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. Печень, почки, надпочечники и яички следует взвешивать влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани (дыхательные пути, печень, почки, селезенка, надпочечники, сердце и любые органы с грубыми поражениями или изменениями размеров) следует сохранить в подходящей среде для возможного будущего гистопатологического исследования. Носоглотку и легкие следует удалить неповрежденными, взвесить и обработать подходящим фиксатором, чтобы гарантировать сохранение структуры легких. Перфузия фиксатором считается эффективной процедурой.

1.6.3.2. Гистопатологическое исследование

В группе с высокой концентрацией и в контроле(ях) гистологическое исследование следует проводить на сохранившихся органах и тканях. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в любых сателлитных группах следует исследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.,

- условия испытаний:

Описание устройства для воздействия, включая конструкцию, тип, размеры, источник воздуха, систему генерации твердых частиц и аэрозолей, метод кондиционирования воздуха, обработку отработанного воздуха и метод содержания животных в испытательной камере, когда он используется. Должно быть описано оборудование для измерения температуры, влажности и, при необходимости, стабильности концентрации аэрозоля или размера частиц.

Данные о воздействии:

Они должны быть сведены в таблицу и представлены со средними значениями и мерой изменчивости (например, стандартное отклонение) и должны, если возможно, включать: (a) скорости потока воздуха через ингаляционное оборудование;

б) температура и влажность воздуха;

(c) номинальные концентрации (общее количество испытуемого вещества, подаваемого в ингаляционное оборудование, деленное на объем воздуха);

(d) характер транспортного средства, если оно используется;

(д) фактические концентрации в зоне тестового дыхания;

(f) средние размеры частиц (где применимо),

- данные о токсической реакции по полу и концентрации,

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до завершения,

- описание токсических или иных эффектов; уровень отсутствия эффекта,

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующего течения,

- данные о еде и весе тела,

- проведенные гематологические исследования и их результаты,

- проведенные клинические биохимические исследования и их результаты,

- результаты вскрытия,

- подробное описание всех гистопатологических результатов,

- статистическую обработку результатов, где это возможно,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

B. 9. ПОДОКРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (КОЖНАЯ)

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A),

1.2. Определения

См. «Общее введение», часть B (B),

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Испытуемое вещество наносят ежедневно на кожу градуированными дозами нескольким группам экспериментальных животных, по одной дозе на группу, в течение 28 дней. В период применения животных наблюдают ежедневно для выявления признаков токсичности. Животных, погибших во время испытания, вскрывают, а по завершении испытания вскрывают выживших животных.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Животных содержат в экспериментальных условиях содержания и кормления в течение по меньшей мере пяти дней перед испытанием. Перед испытанием здоровых молодых животных рандомизируют и распределяют в экспериментальную и контрольную группы. Незадолго до тестирования у испытуемых животных состригают шерсть со спинной части туловища. Можно бриться, но его следует проводить примерно за 24 часа до исследования. Повторная стрижка или бритье обычно необходимы примерно с еженедельными интервалами. При стрижке или бритье шерсти следует соблюдать осторожность, чтобы не поцарапать кожу. Не менее 10 % площади поверхности тела должно быть свободным для нанесения испытуемого вещества. При определении площади, подлежащей очистке, и размеров укрытия следует учитывать вес животного. При испытании твердых веществ, которые при необходимости можно измельчить в порошок, испытуемое вещество следует достаточно смочить водой или, при необходимости, подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. Жидкие тестируемые вещества обычно используются неразбавленными. Используется ежедневное применение пять-семь дней в неделю.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Можно использовать взрослую крысу, кролика или морскую свинку. Могут использоваться и другие виды, но их использование потребует обоснования. В начале испытания диапазон изменения веса не должен превышать ± 20 % среднего веса.

1.6.2.2. Число и пол

Для каждого уровня дозы следует использовать не менее 10 животных (пять самок и пять самцов) со здоровой кожей. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если планируются промежуточные умерщвления, их количество должно быть увеличено на количество животных, запланированных к умерщвлению до завершения исследования. Кроме того, вспомогательную группу из 10 животных (по пять животных каждого пола) можно лечить высокими дозами в течение 28 дней и наблюдать за обратимостью, стойкостью или отсроченным появлением токсических эффектов в течение 14 дней после лечения.

1.6.2.3. Уровни доз

Требуется как минимум три уровня дозы для контроля или для контроля транспортного средства, если используется транспортное средство. Продолжительность воздействия должна составлять не менее шести часов в день. Применение тестируемого вещества следует производить в одно и то же время каждый день и корректировать с интервалами (еженедельно или раз в две недели), чтобы поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного. За исключением обработки тестируемыми веществами, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с субъектами экспериментальной группы. Если для облегчения дозирования используется носитель, контрольная группа носителя должна получать дозу таким же образом, как и группы, получавшие лечение, и получать то же количество, что и группа с самым высоким уровнем дозы. Самый высокий уровень дозы должен приводить к токсическим эффектам, но приводить к отсутствию или небольшому числу смертельных исходов. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать каких-либо доказательств или токсичности. Если имеется подходящая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать этот уровень. В идеале промежуточный уровень дозы должен вызывать минимальные наблюдаемые токсические эффекты. Если используется более одной промежуточной дозы, уровни доз должны быть разнесены так, чтобы обеспечить градацию токсических эффектов. В группах низкой и средней тяжести, а также в контрольной группе частота смертельных исходов должна быть низкой, чтобы можно было провести значимую оценку результатов.

Если нанесение испытуемого вещества вызывает сильное раздражение кожи, его концентрацию следует снизить, что может привести к уменьшению или отсутствию других токсических эффектов при высоких дозах. Более того, если кожа сильно повреждена, может возникнуть необходимость прекратить исследование и провести новое исследование с более низкими концентрациями.

1.6.2.4. Предельный тест

Если предварительное исследование при уровне дозы 1000 мг/кг или более высоком уровне дозы, связанном с возможным воздействием на человека, если это известно, не оказывает токсических эффектов, дальнейшее тестирование может не считаться необходимым.

1.6.2.5. Период наблюдения

Экспериментальных животных следует ежедневно наблюдать на предмет признаков токсичности. Следует фиксировать время смерти и время появления и исчезновения признаков токсичности.

1.6.3. Процедура

Животные должны содержаться в клетках индивидуально. Животных обрабатывают тестируемым веществом, в идеале, семь дней в неделю в течение 28 дней. Животные в любых вспомогательных группах, запланированных для последующего наблюдения, должны содержаться в течение следующих 14 дней без лечения для выявления выздоровления или сохранения токсических эффектов. Время воздействия должно составлять не менее шести часов в день.

Испытуемое вещество следует наносить равномерно на площадь, составляющую примерно 10 % общей площади поверхности тела. В случае высокотоксичных веществ площадь покрытия может быть меньше, но как можно большая часть площади должна быть покрыта как можно более тонким и равномерным слоем.

Во время воздействия испытуемое вещество удерживается в контакте с кожей с помощью пористой марлевой повязки и нераздражающей ленты. Место проведения испытаний должно быть дополнительно накрыто соответствующим образом, чтобы сохранить марлевую повязку и испытуемое вещество и гарантировать, что животные не смогут проглотить испытуемое вещество. Для предотвращения проглатывания тестируемого вещества можно использовать ограничители, но полная иммобилизация не является рекомендуемым методом.

В конце периода воздействия остатки испытуемого вещества следует удалить, если это практически возможно, с помощью воды или другого подходящего метода очистки кожи.

За всеми животными следует наблюдать ежедневно и регистрировать признаки токсичности, включая время начала, их степень и продолжительность. Наблюдения в клетках должны включать изменения кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, а также дыхательной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения. Измерения веса животных следует проводить еженедельно. Также рекомендуется еженедельно измерять потребление пищи. Необходимо регулярное наблюдение за животными, чтобы гарантировать, что животные не выпадают из исследования по таким причинам, как каннибализм, аутолиз тканей или неправильное размещение. В конце периода исследования все выжившие в группах неспутникового лечения подвергаются вскрытию. Умирающих животных следует удалять и подвергать вскрытию, если их заметили.

В конце испытания на всех животных, включая контрольных, должны быть проведены следующие исследования: 1. гематологические исследования, включая, по крайней мере, гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общее и дифференциальное количество лейкоцитов, а также оценку потенциала свертывания крови;

2. клиническая биохимия крови, включающая по крайней мере один параметр функции печени и почек: сывороточная аланинаминотрансфераза (ранее известная как глутамин-пировиноградная трансаминаза), сывороточная аспартатаминотрансфераза (ранее известная как глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза), азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий билирубин и общий белок сыворотки.

Другие определения, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают кальций, фосфор, хлорид, натрий, калий, глюкозу натощак, анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина и активности холинэстеразы.

При необходимости может быть использована дополнительная клиническая биохимия для расширения исследования наблюдаемых эффектов.

1.6.4. Полное вскрытие

Все животные, участвующие в исследовании, должны быть подвергнуты полному вскрытию. Печень, почки, надпочечники и яички следует взвешивать влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы и ткани, то есть нормальная и обработанная кожа, печень, почки и органы-мишени (то есть те органы, в которых наблюдаются грубые повреждения или изменения в размерах), должны быть сохранены в подходящей среде для возможного будущего гистопатологического исследования.

1.6.5. Гистопатологическое исследование

В группе высоких доз и в контрольной группе следует проводить гистологическое исследование сохранившихся органов и тканей. Органы и ткани, демонстрирующие дефекты, связанные с испытуемым веществом при самой высокой дозировке, должны быть исследованы во всех группах с более низкой дозой. Животных в вспомогательной группе следует обследовать гистологически, уделяя особое внимание органам и тканям, в которых выявлены эффекты в других обработанных группах.

2. ДАННЫЕ

Данные следует суммировать в табличной форме, показывая для каждой испытательной группы количество животных в начале испытания и количество животных, демонстрирующих каждый тип поражения.

Все наблюдаемые результаты следует оценивать с помощью соответствующего статистического метода. Можно использовать любой признанный статистический метод.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - данные о животных (вид, штамм, источник, условия окружающей среды, рацион и т. д.),

- условия испытаний,

- уровни доз (включая носитель, если он используется) и концентрации,

- уровень отсутствия воздействия, где это возможно,

- данные о токсической реакции с разбивкой по полу и дозе,

- время смерти во время исследования или дожили ли животные до завершения,

- токсическое или иное воздействие,

- время наблюдения каждого аномального признака и его последующего течения,

- данные о еде и весе тела,

- проведенные гематологические исследования и их результаты,

- проведенные клинические биохимические исследования и их результаты,

- результаты вскрытия,

- подробное описание всех гистопатологических результатов,

- статистическая обработка результатов, где это возможно,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

B. 10. ДРУГИЕ ЭФФЕКТЫ – МУТАГЕННОСТЬ IN VITRO ЦИТОГЕННЫЙ ТЕСТ НА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A),

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B),

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Цитогенетический тест in vitro представляет собой краткосрочный тест на мутагенность для выявления структурных хромосомных аберраций в культивируемых клетках млекопитающих. Могут быть использованы культуры установленных клеточных линий, а также первичные клеточные культуры. После воздействия тестируемых химических веществ со смесью для активации ферментов печени и без нее (постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора) клеточные культуры обрабатывают ингибиторами веретена, такими как колхицин, для накопления клеток на метафазной стадии митоза (c-метафаза). . Клетки собирают в подходящее время и готовят препараты хромосом. Препараты окрашивают и метафазные клетки анализируют на наличие хромосомных аномалий.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Тестируемые химикаты готовят в культуральной среде или растворяют в соответствующих носителях перед обработкой клеток. Используют устоявшиеся клеточные линии или культуры первичных клеток, например. Клетки китайского хомячка и лимфоциты человека.

1.6.2. Условия испытаний

Количество культур:

Для каждой экспериментальной точки используют как минимум дублирующие культуры.

Использование отрицательного и положительного контроля:

Растворитель (если растворителем не является культуральная среда или вода), смесь для активации ферментов печени, смесь для активации ферментов печени и растворитель, а также необработанные контроли используются в качестве отрицательных контролей.

В каждый эксперимент включен положительный контроль; когда для активации тестируемого химического вещества используется смесь для активации ферментов печени, в качестве положительного контроля необходимо использовать соединение, о котором известно, что оно требует метаболической активации.

Уровень дозы:

Используют по меньшей мере три дозы тестируемого соединения по меньшей мере в одном логарифмическом диапазоне доз, причем самая высокая доза подавляет митотическую активность примерно на 50%.

Условия культивирования:

Используются подходящая культуральная среда и условия инкубации (например, температура, используемые культуральные сосуды, концентрация CO2 и влажность).

1.6.3. Процедура 1.6.3.1. Подготовка культур

Установленные клеточные линии: Клетки получают из исходных культур (например, путем трипсинизации или стряхивания), высевают в культуральные сосуды с соответствующей плотностью и инкубируют при 37 °C.

Лимфоциты человека: гепаринизированную цельную кровь добавляют к культуральной среде, содержащей фитогемагглютинин, фетальную телячью сыворотку и антибиотики, и инкубируют при 37°C.

1.6.3.2. Обработка культур тестируемым соединением (i) Обработка без смеси, активирующей ферменты печени

Все обработки должны охватывать период одного целого клеточного цикла, а схемы фиксации должны обеспечивать анализ первых после обработки митозов клеток, обработанных на разных стадиях цикла.

Когда обработка не охватывает длину одного целого клеточного цикла, выбирают несколько времен фиксации для отбора проб клеток, которые находятся на разных стадиях клеточного цикла во время лечения, то есть G1, S и G2.

Тестируемое химическое вещество добавляется в культуры устоявшихся клеточных линий, когда они находятся на экспоненциальной стадии роста. Культуры лимфоцитов человека обрабатывают, пока они находятся в полусинхронном состоянии.

Если тестируемое химическое вещество изменяет продолжительность клеточного цикла, интервал фиксации необходимо соответствующим образом изменить.

(ii) Лечение смесью для активации ферментов печени

Для лечения тестируемое соединение в сочетании с системой активации должно присутствовать как можно дольше, не оказывая токсического воздействия на клетки. Если по причинам токсичности эта обработка не охватывает длину всего клеточного цикла, выбирают несколько времен фиксации для отбора проб клеток, которые находятся на разных стадиях клеточного цикла во время обработки, то есть G1, S и G2.

Сбор клеток:

Культуры клеток обрабатывают ингибитором веретена за один-два часа до сбора. Каждую культуру собирают и обрабатывают отдельно для получения хромосом.

1.6.3.3. Подготовка хромосом

Препараты хромосом включают гипотоническую обработку клеток, фиксацию, нанесение на предметные стекла и окрашивание.

Анализ:

На предмет хромосомных аберраций анализируют не менее 100 широко распространённых метафаз на культуру. Слайды кодируются перед анализом. В лимфоцитах человека анализируются только метафазы, содержащие 46 центромер.

В устоявшихся клеточных линиях анализируют только метафазы, содержащие ± 2 центромеры модального числа.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. Аберрации хроматидного типа (пробелы, разрывы, перестановки), аберрации хромосомного типа (пробелы, разрывы, минуты, кольца, дицентрики, полицентрики) и количество аберрантных метафаз (включая и исключая пробелы) указаны отдельно для всех обработанных и контрольных культур. . Данные оцениваются соответствующими статистическими методами.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - использованные элементы,

- условия испытаний: состав среды, концентрация CO2, температура инкубации, время инкубации, уровни доз, время обработки, продолжительность обработки и концентрация используемого ингибитора веретена, тип используемой смеси для активации ферментов печени, положительные и отрицательные контроли,

- количество клеточных культур,

- количество проанализированных метафаз (данные приводятся отдельно для каждой культуры),

- митотический индекс,

- тип и количество аберраций, приведенных отдельно для каждой обработанной и контрольной культуры, модальное число хромосом в используемых установленных клеточных линиях,

- статистическая оценка,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 11. ДРУГИЕ ЭФФЕКТЫ – МУТАГЕННОСТЬ IN VIVO КОСТНЫЙ МОЗГ МЛЕКОПИТАЮЩИХ – ЦИТОГЕННЫЙ ТЕСТ, ХРОМОСОМНЫЙ АНАЛИЗ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Этот цитогенетический тест in vivo представляет собой краткосрочный тест на мутагенность для выявления структурных хромосомных аберраций. Хромосомные аберрации обычно оцениваются в первых митозах после лечения. При химических мутагенах большинство вызываемых аберраций относятся к хроматидному типу.

В этом методе используются клетки костного мозга млекопитающих, которые подвергаются воздействию тестируемых химикатов соответствующими путями и умерщвляются через последовательные промежутки времени. Перед умерщвлением животных дополнительно обрабатывают ингибитором веретена, таким как колхицин, для накопления клеток на метафазоподобной стадии митоза (с-метафаза). Из клеток изготавливают высушенные на воздухе препараты хромосом, окрашивают их, а метафазы анализируют микроскопически на наличие хромосомных аберраций.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Испытуемые химикаты растворяются в физиологическом растворе. Если они нерастворимы, их растворяют или суспендируют в соответствующих носителях.

Используют свежеприготовленные растворы испытуемого соединения. Если для облегчения дозирования используется носитель, он не должен мешать тестируемому соединению или оказывать токсическое воздействие.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Используются виды грызунов, такие как крысы, мыши или китайские хомяки. Здоровые молодые взрослые животные рандомизируются и распределяются на экспериментальную и контрольную группы.

1.6.2.2. Число и пол

Используют не менее пяти самок и пяти самцов на экспериментальную и контрольную группы. Таким образом, 10 животных будут умерщвляться за период времени на группу, если в график экспериментов будет включено несколько испытаний после лечения.

1.6.2.3. Путь введения

Тестируемые соединения обычно следует вводить только один раз. На основании токсикологической информации можно использовать повторную схему лечения. Однако схему повторного лечения можно применять только в том случае, если тестируемое соединение не оказывает цитотоксического действия на костный мозг. Обычными путями введения являются пероральные и внутрибрюшинные инъекции. Другие пути введения могут быть подходящими.

1.6.2.4. Использование отрицательного и положительного контроля.

Соединение, которое, как известно, вызывает хромосомные аберрации in vivo, используется в качестве положительного контроля, а группа отрицательного контроля (растворитель) также включается в план каждого эксперимента.

1.6.2.5. Уровень дозы

В качестве базового набора используют одну дозу тестируемого соединения, причем доза представляет собой максимально переносимую дозу или дозу, вызывающую некоторые признаки цитотоксичности (например, частичное ингибирование митоза).

Дополнительные уровни дозы могут использоваться, если это указано по научным соображениям.

Если тест используется в качестве метода проверки, следует использовать как минимум два дополнительных уровня дозы.

1.6.3. Процедура

Тест можно проводить двумя способами: (i) Животных обрабатывают тестируемым соединением один раз в самой высокой переносимой дозе. Пробы отбирают трижды после обработки. Центральный интервал отбора проб составляет 24 часа. Поскольку тестируемое химическое вещество может влиять на кинетику клеточного цикла, применяется один более ранний и один более поздний интервал отбора проб, равномерно распределенный в диапазоне от шести до 48 часов.

При использовании дополнительных уровней доз образцы следует брать через особо чувствительные интервалы или, если это неизвестно, через 24 часа после лечения.

(ii) Если фармакокинетические и метаболические данные указывают на необходимость повторного лечения, можно использовать повторную дозировку, а образцы следует взять через шесть и 24 часа после последнего лечения.

Препарат костного мозга:

Перед умерщвлением животным внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу ингибитора веретена для получения адекватного количества клеток в c-метафазе. Костный мозг получают из обоих бедер свежеубитых животных путем промывания изотоническим раствором. После соответствующей гипотонической обработки клетки фиксируют, а затем распределяют по предметным стеклам. После высыхания на воздухе предметные стекла окрашиваются.

Анализ:

Слайды кодируются перед микроскопическим анализом. На одно животное анализируют не менее 50 хорошо распределенных метафаз с полным числом центромер на наличие структурных хромосомных аберраций. Дополнительно для каждого животного могут быть установлены митотические индексы.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. Аберрации типа хроматид и изохроматид (пробелы, разрывы, обмены) и митотические индексы, если они установлены, указаны отдельно для всех обработанных и контрольных животных. Также указаны средние числа и стандартные отклонения для каждой экспериментальной и контрольной группы. Данные оцениваются соответствующими статистическими методами.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, порода и возраст использованных животных,

- количество животных каждого пола в опытных и контрольных группах,

- условия испытаний: подробное описание лечения и графика отбора проб, уровни доз, продолжительность лечения и концентрация используемого ингибитора веретена,

- количество проанализированных метафаз на животное,

- митотические индексы, если они установлены,

- тип и количество отклонений указаны отдельно для каждого обработанного и контрольного животного,

- статистическая оценка,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКА

См. «Общее введение», часть B (D).

Б. 12. ПРОЧИЕ ЭФФЕКТЫ – МИКРОНЯДЕРНЫЙ ТЕСТ НА МУТАГЕННОСТЬ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода испытаний

Микроядерный тест — это кратковременный тест in vivo на млекопитающих для выявления хромосомных повреждений или повреждения митотического аппарата химическими веществами. В основе этого анализа лежит увеличение количества микроядер в полихроматических эритроцитах обработанных животных по сравнению с контрольной группой.

Микроядра образуются из хромосомных фрагментов или целых хромосом, отстающих в митозе. Когда эритробласты превращаются в эритроциты, главное ядро ​​выбрасывается, а микроядро может сохраняться в цитоплазме. В этом тесте используются молодые полихроматические эритроциты костного мозга лабораторных млекопитающих, подвергшихся воздействию тестируемых веществ соответствующими путями. Костный мозг извлекают, готовят и окрашивают мазки. Полихроматические эритроциты оценивают по микроядрам под микроскопом и устанавливают соотношение полихроматических и нормохроматических эритроцитов.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты

Испытуемые химикаты растворяют в изотоническом растворе. Если они нерастворимы, их растворяют или суспендируют в соответствующих носителях. Если используется носитель, он не должен мешать тестируемому соединению или оказывать токсическое воздействие. Обычно используют свежеприготовленные растворы тестируемого соединения.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Экспериментальные животные

Рекомендуется использовать мышей, но можно использовать и других млекопитающих. Здоровые молодые взрослые животные рандомизируются и распределяются на экспериментальную и контрольную группы.

1.6.2.2. Число и пол

Используют не менее пяти самок и пяти самцов на экспериментальную и контрольную группы. Таким образом, 10 животных будут умерщвляться за период времени на группу, если в график экспериментов будет включено несколько испытаний после лечения.

1.6.2.3. Путь введения

Тестируемые соединения обычно следует вводить только один раз. На основании токсикологической информации можно использовать повторную схему лечения. Однако схему повторного лечения можно применять только в том случае, если тестируемое соединение не оказывает цитотоксического действия на костный мозг. Обычными путями введения являются пероральные и внутрибрюшинные инъекции. Другие пути введения могут быть подходящими.

1.6.2.4. Использование отрицательного и положительного контроля.

В каждом эксперименте следует использовать как положительный, так и отрицательный (растворяющий) контроль.

1.6.2.5. Уровень дозы

В качестве базового набора используют одну дозу тестируемого соединения, при этом доза представляет собой максимально переносимую дозу или дозу, вызывающую некоторые признаки цитотоксичности, например изменением соотношения полихроматических и нормохроматических эритроцитов.

Дополнительные уровни дозы могут использоваться, если это указано по научным соображениям.

Если тест используется в качестве метода проверки, следует использовать как минимум два дополнительных уровня дозы.

1.6.3. Процедура

Тест можно проводить двумя способами: (i) Животных обрабатывают тестируемым соединением один раз в самой высокой переносимой дозе. Время отбора проб должно совпадать с максимальным ответом анализа, который варьируется в зависимости от тестируемого соединения. Поэтому при использовании максимальной дозы образцы костного мозга берут не менее трех раз, начиная не ранее, чем через 12 часов после лечения, с соответствующими интервалами после первого анализа, но не превышающими 72 часов.

При использовании дополнительных уровней доз образцы следует брать в период максимальной чувствительности или, если это неизвестно, через 24 часа после лечения.

(ii) Если фармакокинетические и метаболические данные указывают на повторный график лечения, можно использовать повторную дозировку, и следует брать образцы не менее трех раз, начиная не ранее, чем через 12 часов после последнего лечения, и через соответствующие промежутки времени после первого образца, но не далее 72 часа.

Препарат костного мозга:

Костный мозг получают из обоих бедренных костей свежеубитых животных путем промывки эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки осаждают центрифугированием и супернатант отбрасывают. Капли гомогенной клеточной суспензии наносят на предметные стекла и распределяют в виде мазка. После высыхания на воздухе предметные стекла окрашиваются.

Анализ:

Слайды кодируются перед микроскопическим анализом. На наличие микроядер подсчитывают не менее 1000 полихроматических эритроцитов на животное.

Соотношение нормохромных и полихромных эритроцитов определяют для каждого животного путем подсчета всего 1000 эритроцитов.

2. ДАННЫЕ

Данные представлены в табличной форме. При этом количество подсчитанных полихроматических эритроцитов, количество полихроматических эритроцитов с микроядрами и процент микроядерных клеток указаны отдельно для каждого подопытного и контрольного животного, а также соотношение нормохроматических и полихроматических эритроцитов. Также указаны средние числа и стандартные отклонения для каждой экспериментальной и контрольной группы. Перечисленные данные оценены соответствующими статистическими методами.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - вид, порода и возраст использованных животных,

- количество животных каждого пола в опытных и контрольных группах,

- условия испытаний: подробное описание режима лечения и графика отбора проб, уровни доз, данные о токсичности, отрицательный и положительный контроль,

- критерии оценки микроядер,

- взаимосвязь доза/эффект, когда это возможно,

- статистическая оценка,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

B. 13. ДРУГИЕ ЭФФЕКТЫ – МУТАГЕННОСТЬ ESCHERICHIA COLI – АНАЛИЗА ОБРАТНОЙ МУТАЦИИ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Справочные вещества

Никто.

1.4. Принципы метода испытаний >PIC FILE="T0027401">

Бактерии подвергаются воздействию тестируемых химических веществ с метаболической активацией и без нее. После соответствующего периода инкубации на минимальной среде ревертантные колонии подсчитывают и сравнивают с количеством спонтанных ревертантов в необработанной контрольной культуре и/или контрольной культуре с растворителем.

1,5. Критерии качества

Никто.

1.6. Описание метода испытаний

Для проведения анализа можно использовать следующие методы: (1) метод преинкубации; и (2) метод прямого включения, при котором бактерии и тестируемый агент смешивают в верхнем агаре и выливают на поверхность пластинки с селективным агаром. 1.6.1. Подготовка 1.6.1.1. Бактерии

Бактерии выращивают при 37°С до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста. Приблизительная плотность клеток должна составлять от 108 до 109 клеток на миллилитр.

1.6.1.2. Метаболическая активация

Бактерии следует подвергать воздействию тестируемого вещества как в присутствии, так и в отсутствие соответствующей смеси для активации ферментов печени млекопитающих (постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора), полученной от мышей или крыс, предварительно обработанных агентами, индуцирующими ферменты.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Тестовые штаммы

Следует использовать три штамма: WP2, WP2 uvr A и WP2 uvr A pKM 101. Должны использоваться признанные методы приготовления и хранения маточных культур. Необходимо проверить ростовые требования и генетическую идентичность штаммов, их чувствительность к УФ-излучению или митомицину С и устойчивость к ампициллину у штамма WP2 uvr A pKM 101. Штаммы также должны давать спонтанные ревертанты в ожидаемых диапазонах частот.

1.6.2.2. СМИ

Подходящую среду для экспрессии и отбора мутантов используют с соответствующим верхним агаром.

1.6.2.3. Использование отрицательного и положительного контроля.

Необходимо проводить одновременный контроль необработанных веществ и растворителей. Положительный контроль необходимо проводить также для двух целей: (i) Для подтверждения чувствительности бактериальных штаммов.

Метилметансульфонат, оксид 4-нитрохинолина или этилнитрозомочевина могут использоваться в качестве положительного контроля для тестов без метаболической активации.

(ii) Обеспечить активность соответствующих метаболизирующих систем.

Положительным контролем активности одной (одной) метаболизирующей системы для всех штаммов является 2-аминоантрацен. Если возможно, следует использовать положительный контроль того же химического класса, что и испытуемое химическое вещество.

1.6.2.4. Количество тестируемого вещества на чашку

Испытывают не менее пяти различных количеств тестируемого химиката с полулогарифмическими интервалами между чашками. Вещества проверяются до предела растворимости или токсичности. О токсичности свидетельствует уменьшение количества спонтанных ревертантов, очистка фонового газона или степень выживаемости обработанных культур. Нетоксичные химические вещества следует проверять в концентрации 5 мг на чашку, прежде чем считать испытуемое вещество отрицательным.

1.6.2.5. Условия инкубации

Планшеты инкубируют от 48 до 72 часов при 37°С.

1.6.3. Процедура

Для метода прямого внесения в чашку без активации фермента химикат и 0,1 мл свежей бактериальной культуры добавляют к 2,0 мл агара верхнего слоя. Для тестов с метаболической активацией к агару после добавления тестируемого химиката и бактерий добавляют 0,5 мл смеси для активации ферментов печени, содержащей достаточное количество постмитохондриальной фракции. Содержимое каждой пробирки перемешивают и выливают на поверхность чашки с селективным агаром. Наложенному агару дают затвердеть и чашки инкубируют при 37°C в течение 48–72 часов. В конце инкубационного периода подсчитывают ревертантные колонии на чашке.

Для метода преинкубации смесь тестируемого химиката, 0,1 мл свежей бактериальной культуры и достаточного количества смеси для активации ферментов печени или такого же количества буфера предварительно инкубируют перед добавлением 2,0 мл верхнего слоя агара. Все остальные процедуры такие же, как и для метода включения.

Все посевы для обоих методов выполняются как минимум в трех экземплярах.

2. ДАННЫЕ

Количество ревертантных колоний на чашку указывается как для контрольной, так и для обработанной серии. Необходимо представить подсчет отдельных чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартные отклонения для тестируемого химического вещества и контроля. Все результаты подтверждены в независимом эксперименте. Данные следует оценивать с использованием соответствующих статистических методов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - бактерии, использованный штамм,

- условия испытаний: уровни доз, токсичность, состав сред; лечебные процедуры (прединкубационная инкубация); смесь для активации ферментов печени; эталонные вещества, отрицательные контроли,

- индивидуальный подсчет чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку, стандартное отклонение, соотношение доза/эффект, если это возможно,

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

B. 14. ДРУГИЕ ЭФФЕКТЫ – МУТАГЕННОСТЬ SALMONELLA TYPHIMURIUM – АНАЛИЗА ОБРАТНОЙ МУТАЦИИ

1. МЕТОД 1.1. Введение

См. «Общее введение», часть B (A).

1.2. Определение

См. «Общее введение», часть B (B).

1.3. Эталонные вещества

Никто.

1.4. Принцип метода тестирования >PIC FILE="T0027402">

Бактерии подвергают воздействию тестируемых химикатов с метаболической активацией и без нее и высеивают на минимальную среду. После соответствующего периода инкубации ревертантные колонии подсчитывают и сравнивают с количеством спонтанных ревертантов в необработанной культуре и/или контрольной культуре с растворителем.

1,5. Критерии качества

Никто

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Препараты 1.6.1.1. Бактерии

Свежие культуры бактерий выращивают при 37°С до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста. Приблизительная плотность клеток должна составлять от 108 до 109 клеток на миллилитр.

1.6.1.2. Метаболическая активация

Бактерии следует подвергать воздействию тестируемого вещества как в присутствии, так и в отсутствие соответствующей смеси для активации ферментов печени млекопитающих (постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора), полученной от мышей или крыс, предварительно обработанных агентами, индуцирующими ферменты.

1.6.2. Условия испытаний 1.6.2.1. Тестовые штаммы

Необходимо использовать по меньшей мере четыре штамма ТА 1535, ТА 1537, ТА 98 и ТА 100; Дополнительно можно использовать другие штаммы, такие как ТА 1538. Должны использоваться признанные методы приготовления и хранения маточных культур. Необходимо проверить ростовые требования и генетическую идентичность штаммов, их чувствительность к УФ-излучению и кристаллическому фиолетовому, а также устойчивость к ампициллину. Штаммы также должны давать спонтанные ревертанты в ожидаемых диапазонах частот.

1.6.2.2. СМИ

Подходящую селективную среду используют с соответствующим верхним агаром.

1.6.2.3. Использование отрицательного и положительного контроля.

Необходимо проводить одновременный контроль необработанных веществ и растворителей. Положительный контроль необходимо проводить также для двух целей: (i) Для подтверждения чувствительности бактериальных штаммов.

Следующие соединения могут использоваться для тестов без метаболической активации: >PIC FILE="T0027403">

(ii) Обеспечить активность соответствующей метаболизирующей системы.

Положительным контролем активности одной метаболизирующей системы для всех штаммов является 2-аминоантрацен. Если доступен положительный контроль того же химического класса, что и испытуемое химическое вещество, следует использовать его.

1.6.2.4. Количество тестируемого вещества на чашку

Испытывают не менее пяти различных количеств тестируемого химиката с полулогарифмическими интервалами между чашками. Вещества проверяются до предела растворимости или токсичности. О токсичности свидетельствует уменьшение количества спонтанных ревертантов, очистка фонового газона или степень выживаемости обработанных культур. Нетоксичные химические вещества следует проверять в концентрации 5 мг на чашку, прежде чем считать испытуемое вещество отрицательным.

1.6.2.5. Условия инкубации

Планшеты инкубируют от 48 до 72 часов при температуре 37°C.

1.6.3. Процедура

Для метода прямого включения в чашку без активации фермента тестируемое вещество и 0,1 мл свежей бактериальной культуры добавляют к 2,0 мл агара верхнего слоя. Для тестов с метаболической активацией 0,5 мл смеси для активации ферментов печени, содержащей достаточное количество постмитохондриальной фракции, добавляют к агару после добавления тестируемого химиката и бактерий. Содержимое каждой пробирки перемешивают и выливают на поверхность чашки с селективным агаром. Наложенному агару дают затвердеть и чашки инкубируют при 37°C в течение 48–72 часов. В конце инкубационного периода подсчитывают ревертантные колонии на чашке. Для метода преинкубации смесь тестируемого химиката, 0,1 мл свежей бактериальной культуры и достаточного количества смеси для активации ферментов печени или такого же количества буфера предварительно инкубируют перед добавлением 2,0 мл верхнего агара. Все остальные процедуры такие же, как и для метода прямого включения пластины.

Все посевы для обоих методов выполняются как минимум в трех экземплярах.

2. ДАННЫЕ

Количество ревертантных колоний на чашку указывается как для контрольной, так и для обработанной серии.

Необходимо представить подсчет отдельных чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение для тестируемого химического вещества и контроля.

Все результаты подтверждены в независимом эксперименте.

Данные следует оценивать с использованием соответствующих статистических методов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен, если возможно, включать следующую информацию: - бактерии, использованный штамм,

- условия испытаний: уровни доз, токсичность, состав сред, процедуры обработки (преинкубация, инкубация), смесь для активации ферментов печени, эталонные вещества, отрицательные, контроли,

- индивидуальный подсчет чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку, стандартное отклонение, соотношение доза/эффект, если это возможно;

- обсуждение результатов,

- интерпретация результатов.

3.2. Оценка и интерпретация

См. «Общее введение», часть B (C).

4. ССЫЛКИ

См. «Общее введение», часть B (D).

ЧАСТЬ C: МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИЧНОСТИ

C. 1. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ДЛЯ РЫБ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Желательно иметь, насколько это возможно, информацию о растворимости в воде, давлении паров, химической стабильности, константах диссоциации и биоразлагаемости испытуемого вещества, чтобы помочь в выборе наиболее подходящего метода испытания (статического, полустатического или проточного). -сквозной) для обеспечения удовлетворительно постоянных концентраций испытуемого вещества в течение всего периода испытания.

Требуется другая информация, например. Структурная формула, степень чистоты, природа и процентное содержание существенных примесей, наличие и количество добавок, а также коэффициент распределения н-октанол/вода должны учитываться как при планировании, так и при интерпретации результатов испытания.

1.2. Определения и единицы измерения

Острая токсичность – это заметное неблагоприятное воздействие, возникающее в организме в течение короткого времени (дней) воздействия вещества. В настоящем испытании острая токсичность выражается как медианная летальная концентрация (LC50), то есть концентрация в воде, при которой погибает 50 % исследуемой партии рыбы в течение непрерывного периода воздействия, который необходимо указать.

Все концентрации испытуемого вещества указаны в объемном весе (миллиграммы на литр), а также выражены в весовых единицах (частей на миллион).

1.3. Эталонные вещества

Эталонное вещество может быть протестировано, чтобы продемонстрировать, что в условиях лабораторных испытаний реакция тестируемых видов существенно не изменилась.

Для этого теста не указаны эталонные вещества.

1.4. Принцип метода испытаний

Рыб подвергают воздействию тестируемого(ых) вещества(й), добавленного(ых) в воду в различных концентрациях, в течение как минимум 48 часов, но предпочтительно в течение 96 часов. Смертность регистрируется не реже, чем через 24 часа, и, где это возможно, рассчитываются концентрации, вызывающие гибель 50 % рыбы (LC50) в каждый момент наблюдения.

1,5. Критерии качества

Смертность в контрольной группе не должна превышать 10 % в конце испытания.

Концентрация кислорода должна была составлять более 60 % от значения насыщения воздуха.

Должны быть доказательства, полученные либо анализом, либо химическими свойствами, либо используемой тест-системой, что концентрация испытуемого вещества поддерживается удовлетворительно (например, в пределах 80 % от первоначальной концентрации в течение периода испытания).

1.6. Описание метода испытаний

Можно использовать три типа процедуры:

Статический тест:

Испытание на токсичность с водными организмами, при которых не происходит вытекания тестируемого раствора. (Решения остаются неизменными на протяжении всего теста.)

Полустатический тест:

Тестируйте без потока раствора, но с регулярным периодическим обновлением тестовых растворов после длительных периодов времени (например, 24 часа).

Тест на проток:

Испытание на токсичность, при котором вода постоянно обновляется в испытательных камерах, при этом испытуемое химическое вещество транспортируется вместе с водой, используемой для обновления испытательной среды. 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Растворы тестируемых веществ

Маточные растворы необходимой концентрации готовят растворением вещества в деионизированной воде или воде по 1.6.1.2.

Маточные растворы веществ с низкой растворимостью в воде можно приготовить путем ультразвукового диспергирования или, при необходимости, с использованием органических растворителей, эмульгаторов или диспергаторов. При использовании таких вспомогательных веществ контрольную рыбу следует подвергать воздействию той же концентрации вспомогательного вещества, что и при самой высокой концентрации испытуемого вещества. Концентрация таких вспомогательных веществ не должна превышать 0,1 г на литр.

Выбранные тестовые концентрации готовят путем разбавления исходного раствора. Если тестируются высокие концентрации, вещество можно растворить непосредственно в воде для разбавления.

Тест следует проводить без корректировки pH. Если есть признаки заметного изменения pH, рекомендуется повторить тест с корректировкой pH и сообщить о результатах. В этом случае значение pH исходного раствора следует привести в соответствие со значением pH воды для разбавления, если только нет особых причин не делать этого. Для этой цели предпочтительны HCl и NaOH. Корректировку pH следует производить таким образом, чтобы концентрация испытуемого вещества в исходном растворе не менялась в сколько-нибудь существенной степени. Если корректировка вызвана какой-либо химической реакцией или физическим осаждением испытуемого соединения, об этом следует сообщить.

1.6.1.2. Вода для хранения и разбавления

Разрешается использовать питьевую воду (не загрязненную опасными концентрациями хлора, тяжелых металлов и других веществ), природную или восстановленную воду хорошего качества (см. Приложение 1). Предпочтительнее использовать воду с общей жесткостью от 50 до 250 мг/л (по CaCO3) и pH от 6,0 до 8,5.

1.6.2. Аппарат

Вся аппаратура должна быть изготовлена ​​из химически инертного материала: - автоматическая система разбавления (для проточного теста),

- кислородный метр,

- оборудование для определения жесткости воды,

- соответствующее оборудование для контроля температуры,

- pH-метр.

1.6.3. Тестовая рыба

Можно использовать один или несколько видов, выбор остается на усмотрение испытательной лаборатории.

Предлагается, чтобы используемые виды отбирались на основе важных практических критериев, таких как их доступность в течение всего года, простота содержания, удобство для тестирования, их относительная чувствительность и любые экономические, биологические или экологические факторы, которые могут иметь какое-либо значение. несущий. Рыба должна быть здоровой и не иметь каких-либо видимых пороков развития.

Рекомендуемые к испытанию виды рыб приведены в приложении 2. 1.6.3.1. Держа

Желательно, чтобы подопытная рыба происходила из одной популяции одинаковой длины и возраста. Рыбу необходимо содержать не менее 12 дней при следующих условиях:

танки:

рекомендуется не менее 300 литров для холодноводных рыб, не менее 100 литров для тепловодных рыб,

загрузка:

подходит для системы (рециркуляция или проточная) и вида рыбы,

вода:

см. пункт 1.6.1.2,

свет:

фотопериод от 12 до 16 часов в день,

концентрация растворенного кислорода:

не менее 80 % значения воздухонасыщения,

кормление:

три раза в неделю или ежедневно, прекращая за 24 часа до начала теста.

1.6.3.2. Смертность

После 48-часового периода адаптации регистрируют смертность и применяют следующие критерии: - более 10 % популяции за семь дней: отбраковка всей партии,

- от 5 до 10 % населения: период выдержки продолжается еще семь дней. Если новых случаев смертности не происходит, партия приемлема, в противном случае она должна быть забракована.

- менее 5 % населения: прием партии.

1.6.4. Приспособление

Вся рыба должна подвергаться воздействию воды того качества и температуры, которые используются в тесте, в течение как минимум семи дней, прежде чем ее использовать.

1.6.5. Тестовая процедура

Тест по определению диапазона может предшествовать окончательному тесту, чтобы получить информацию о диапазоне концентраций, которые будут использоваться в основном тесте.

Проводят один контроль без тестируемого вещества, используя при необходимости вспомогательное вещество в дополнение к серии испытаний.

Концентрации не должны падать более чем на 20 % за время проведения испытания. В зависимости от физических и химических свойств испытуемого соединения для удовлетворения этого требования следует выбрать статическое, полустатическое или проточное испытание.

Рыбы подвергаются воздействию этого вещества, как описано ниже: - продолжительность:

минимум 48 часов, но желательно 96 часов,

- количество животных:

не менее 10 на концентрацию,

- танки:

подходящей мощности в соответствии с рекомендуемой загрузкой,

- загрузка:

рекомендуется максимальная загрузка 1,0 г на литр для статических и полустатических испытаний; для проточных систем допустима более высокая нагрузка,

- тестовая концентрация:

один контроль и не менее пяти концентраций, отличающихся постоянным коэффициентом, не превышающим 1,8 и охватывающих диапазон смертности от 0 до 100 %,

- вода:

см. 1.6.1.2,

- свет:

фотопериод от 12 до 16 часов в день,

- температура:

соответствует виду (Приложение 2), но в пределах ± 1 °C в рамках любого конкретного испытания.

- концентрация растворенного кислорода:

не менее 60 % значения воздухонасыщенности при выбранной температуре,

- кормление:

никто.

Рыбу осматривают через первые 2–4 часа и не реже, чем через 24 часа. Рыбу считают мертвой, если прикосновение к хвостовому стеблю не вызывает реакции и не видно дыхательных движений. Мертвую рыбу удаляют при наблюдении и регистрируют смертность.

Ведутся записи о видимых отклонениях (например, потеря равновесия, изменения в плавательном поведении, дыхательной функции, пигментации и т. д.).

Измерения pH, растворенного кислорода и температуры необходимо проводить ежедневно.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Постройте график процентной смертности для каждого рекомендуемого периода воздействия в зависимости от концентрации на бумаге с логарифмической вероятностью. Поднесите линию к точкам на глаз и определите концентрацию, соответствующую 50% ответу (см. Приложение 3).

Это оценка LC50 для соответствующего периода воздействия.

Если данные адекватны, медианную концентрацию LC50 и ее доверительные пределы (p = 0,05) можно оценить с помощью стандартных процедур.

Значение LC50 следует округлить до одной (или не более двух) значащих цифр.

В тех случаях, когда наклон кривой реакции концентрация/процент слишком крутой, чтобы можно было рассчитать LC50, графической оценки этого значения достаточно.

Когда две последовательные концентрации при соотношении 1,8 дают только 0 и 100% смертности, этих двух значений достаточно, чтобы указать диапазон, в пределах которого находится LC50.

Если обнаруживается, что стабильность или гомогенность испытуемого вещества не могут быть сохранены, об этом следует сообщить и соблюдать осторожность при интерпретации результатов.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет об испытаниях должен, если возможно, содержать: - информацию об тестируемом организме (научное название, штамм, поставщик, предварительная обработка, размер и количество использованных в каждой тестируемой концентрации);

- список используемых концентраций и любую доступную информацию о стабильности концентраций испытуемого химического вещества в испытуемом растворе,

- описание испытательного оборудования,

- если проводятся химические анализы, использованные методы и результаты,

- источник разбавляющей воды и основные химические характеристики (pH, жесткость, температура),

- концентрация любых вспомогательных веществ,

- в случае веществ с низкой растворимостью в воде - метод приготовления исходного и испытуемого раствора.

- причины выбора и подробности используемой процедуры испытания (например, продолжительность испытания, статический, полустатический режим, скорость дозирования, скорость потока, наличие аэрации, загрузка рыбы и т. д.),

- световой режим,

- самая высокая тестируемая концентрация, не вызывающая смертности в течение периода тестирования,

- самая низкая тестируемая концентрация, вызывающая 100% смертность в течение периода тестирования,

- кумулятивная смертность при каждой концентрации и контроль (или контроль с использованием вспомогательного вещества, если необходимо) до рекомендуемого времени наблюдения,

- значения LC50 в каждый из рекомендуемых периодов наблюдения (с доверительным интервалом 95 %, если это возможно),

- статистические процедуры, используемые для определения значений LC50,

- график этой кривой реакции концентрации/процента в конце теста,

- если возможно, наклон кривой концентрации/процентного ответа в конце испытания и ее 95% доверительный интервал,

- концентрацию растворенного кислорода, значения pH и температуру тестируемых растворов каждые 24 часа,

- если используется эталонное вещество, полученные результаты,

- доказательства того, что критерии качества были выполнены.

4. ССЫЛКИ

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 203, Решение Совета C(81) 30 окончательное.

Приложение 1 Восстановленная вода

Пример подходящей воды для разбавления

Все химические вещества должны быть аналитической степени чистоты.

Вода должна быть дистиллированной или деионизированной водой хорошего качества с проводимостью менее 5 ¶См-1.

Стандартные решения >PIC FILE= "T0027404">

Восстановленная вода для разбавления

Смешайте по 25 мл каждого из четырех исходных растворов и доведите до 1 литра водой.

Аэрируйте до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не сравняется со значением насыщения воздуха.

Уровень pH должен составлять 7,9±0,3.

При необходимости отрегулируйте pH с помощью NaOH (гидроксида натрия) или HCl (соляной кислоты).

Приготовленную таким образом воду для разбавления оставляют примерно на 12 часов и не подлежат дальнейшей аэрации.

Сумма ионов Ca и Mg в этом растворе составляет 2,5 ммоль на литр. Соотношение ионов Са:Mg составляет 4:1, ионов Na:K — 10:1. Общая щелочность этого раствора составляет 0,8 ммоль на литр.

Любые отклонения в приготовлении воды для разбавления не должны изменять состав или свойства воды.

Приложение 2 Виды рыб, рекомендуемые для тестирования

>ФАЙЛ ПИК="T0027405">

Коллекция

Перечисленные выше рыбы легко выращивать и/или они широко доступны в течение всего года. Их можно разводить и выращивать либо на рыбных фермах, либо в лаборатории в условиях контроля над болезнями и паразитами, так что подопытное животное будет здоровым и известного происхождения. Эти рыбы доступны во многих частях мира.

Приложение 3 Пример концентрации: процент смертности

Пример определения LC50 с использованием логарифмической бумаги

>ФАЙЛ ПИК="T0027406">

Приложение 4 Перечень примеров стандартной процедуры

(1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 203, Решение Совета, C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ISO/TC/147/SC 5/WG/3. - Проект предложения по проверке химических веществ и продуктов на острую токсичность для рыб с использованием статического, полустатического или проточного метода, Документ 7346/I, II, III, 1980/06/15 ISO/DP.

(3) Федеральный департамент внутренних дел Швейцарии: Руководство по отбору проб и стандартизации методов анализа воды – Часть II, 1974 г.

(4) Методы испытаний DIN с водными организмами, 38 412 (L1) и L (15).

(5) AFNOR, Определение острой токсичности вещества в отношении Brachydanio rerio, T90-303.

(6) JIS K 0102, Испытание на острую токсичность для рыбы.

(7) Разлагаемость, экотоксичность и биоаккумуляция. Определение возможного воздействия химикатов и отходов на водную среду, тома I и II, Государственное издательство, Гаага, Нидерланды, 1980 г.

(8) Агентство по охране окружающей среды, 1975, Методы испытаний на острую токсичность для рыб, макробеспозвоночных и амфибий, Комитет по методам испытаний на токсичность для водных организмов, Серия экологических исследований EPA-660-75-009.

(9) Агентство по охране окружающей среды, январь 1978 г., Лаборатория экологического мониторинга и поддержки, Управление исследований и разработок, EPA-600/4-78-012.

(10) Агентство по охране окружающей среды, Контроль за токсичными веществами, 16 марта 1979 г., часть IV.

(11) Стандартные методы исследования воды и сточных вод, 14-е издание, 1975 г., APHA-AWWA-WPCF.

(12) Комиссия Европейских Сообществ, Программа межлабораторных испытаний по изучению экотоксичности химического вещества по отношению к рыбам, Исследование ЕЭС D. 8368, 22 марта 1979 г.

(13) Личфилд, Дж.Т. и Уилкоксон Ф., Упрощенный метод оценки экспериментов по эффекту дозы, J. Pharm, Exp. Терапия, вып. 96, 1949, с. 99.

C. 2. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ДЛЯ ДАФНИИ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Перед началом испытания желательно иметь, насколько это возможно, информацию о растворимости в воде, давлении паров, химической стабильности, константах диссоциации и биоразлагаемости вещества.

Дополнительную информацию (например, структурную формулу, степень чистоты, природу и процентное содержание существенных примесей, наличие и количество добавок, а также коэффициент распределения н-октанол/вода) следует принимать во внимание как при планировании, так и при интерпретации результатов анализа. тест.

1.2. Определения и единицы измерения

Требование Директивы к LC50 для дафний считается выполненным путем определения EC50, как описано в этом методе испытаний.

Острая токсичность выражается в этом тесте как медианная эффективная концентрация (EC50) для иммобилизации. Это концентрация (в пересчете на начальные значения), которая обездвиживает 50 % дафний в тестовой партии в течение 24-часового периода воздействия. Если это практически возможно, также можно определить 48-часовую ЕС50 для иммобилизации.

Иммобилизация:

Неподвижными считаются животные, которые не способны плавать в течение 15 секунд после легкого встряхивания тест-контейнера.

Все концентрации испытуемого вещества выражаются в массовых долях (частей на миллион).

1.3. Эталонные вещества

Эталонное вещество может быть протестировано как средство демонстрации того, что в условиях лабораторных испытаний чувствительность тестируемого вещества существенно не изменилась.

Для этого теста не указаны эталонные вещества.

1.4. Принцип метода испытаний

Дафнии подвергаются воздействию тестируемого вещества, добавленного в воду в различных концентрациях, в течение 24 часов; при необходимости эта продолжительность может быть увеличена до 48 часов.

При идентичных условиях испытаний и адекватном диапазоне концентраций испытуемого вещества разные концентрации испытуемого вещества оказывают разную среднюю степень воздействия на способность дафний к плаванию. Различные концентрации приводят к разному проценту дафний, которые больше не способны плавать в конце теста. Концентрации, вызывающие нулевую или 100 % иммобилизацию, получают непосредственно из результатов испытаний, тогда как 24-часовая EC50 (или 48-часовая EC50), если это возможно, определяется расчетным путем.

Для этого метода используется статическая система, поэтому тестовые растворы не обновляются в течение периода воздействия.

1,5. Критерии качества

Иммобилизация в контроле не должна превышать 10 % в конце испытания.

Концентрация кислорода в конце испытания не должна быть менее 2 мг/л.

Тестовая дафния не должна была задерживаться на поверхности воды, по крайней мере, в контрольной группе.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Растворы тестируемых веществ

Маточные растворы необходимой концентрации готовят растворением вещества в деионизированной воде или воде по 1.6.1.2.

Маточные растворы веществ с низкой растворимостью в воде можно приготовить методом ультразвукового диспергирования или, при необходимости, с использованием органических растворителей, эмульгаторов или диспергаторов. При использовании таких вспомогательных веществ контрольную дафнию следует подвергать воздействию той же концентрации вспомогательного вещества, что и используемая в самой высокой концентрации испытуемого вещества. Концентрация таких вспомогательных веществ не должна превышать 0,1 г на литр.

Выбранные тестовые концентрации готовят путем разбавления исходного раствора. Если тестируются высокие концентрации, вещество можно растворить непосредственно в воде для разбавления.

Тест следует проводить без корректировки pH. Если есть признаки заметного изменения pH, рекомендуется повторить тест с корректировкой pH и сообщить о результатах. В этом случае значение pH исходного раствора следует привести в соответствие со значением pH растворенной воды, если только нет особых причин не делать этого. Для этой цели предпочтительны HCl и NaOH. Корректировку pH следует производить таким образом, чтобы концентрация испытуемого вещества в исходном растворе не менялась в сколько-нибудь существенной степени. Если корректировка вызвана какой-либо химической реакцией или физическим осаждением испытуемого соединения, об этом следует сообщить.

1.6.1.2. Культуральная и разбавляющая вода

В этом тесте можно использовать любую воду, пригодную для культивирования дафний, как природную, так и восстановленную (см. Приложение). Чтобы избежать необходимости акклиматизации перед тестом, рекомендуется, чтобы культуральная вода была того же качества, что и культуральная вода, используемая для теста.

1.6.2. Аппарат

Следует использовать обычные лабораторные приборы и оборудование. Оборудование, которое будет контактировать с тестируемыми растворами, предпочтительно должно быть полностью изготовлено из стекла: - Кислородомер (с микроэлектродом или другим подходящим оборудованием для измерения растворенного кислорода в пробах небольшого объема),

- соответствующее оборудование для контроля температуры,

- pH-метр,

- оборудование для определения жесткости воды.

1.6.3. Тестовый организм

Daphnia magna или Daphnia pulex, возрастом более шести часов и менее 24 часов, на начало испытания, выведенная в лаборатории, без явных заболеваний и с известным анамнезом (например, разведение - любая предварительная обработка и т. д.).

1.6.4. Тестовая процедура

Тест по определению диапазона может предшествовать окончательному тесту, чтобы получить информацию о диапазоне концентраций, которые будут использоваться в основном тесте. В дополнение к серии испытаний следует провести одно контрольное испытание с использованием любого вспомогательного вещества, но без испытуемого вещества.

Дафнии подвергаются воздействию вещества, как описано ниже: - продолжительность:

не менее 24 часов,

- количество животных:

по меньшей мере 20 животных каждой тестируемой концентрации, предпочтительно разделенные на четыре партии по пять животных в каждой или две партии по 10 животных,

- загрузка:

каждому животному должно быть предоставлено не менее 2 мл тестируемых растворов,

- тестовая концентрация:

Тестовый раствор следует готовить непосредственно перед введением дафнии, желательно без использования какого-либо растворителя, кроме воды. Концентрации составлены в геометрической прогрессии, при соотношении концентраций 1,8. Концентрации, достаточные для обеспечения 0 и 100% иммобилизации через 24 часа, а также диапазон промежуточных степеней иммобилизации, позволяющий рассчитать 24-часовую ЕС50, следует тестировать вместе с контролем.

- вода:

см. 1.6.1.2,

- свет:

цикл свет-темнота необязателен, допускается полная темнота,

- температура:

температура испытания должна находиться в пределах 18–22 °С, но для каждого отдельного испытания она должна быть постоянной в пределах ± 1,0 °С,

- аэрация:

тестовые растворы не должны аэрироваться пузырьками,

- кормление:

никто.

В конце испытания следует измерить pH и концентрацию кислорода в контрольных образцах и во всех тестируемых концентрациях; pH тестируемых растворов не следует изменять.

Летучие соединения следует тестировать в полностью заполненных закрытых контейнерах, достаточно больших, чтобы предотвратить недостаток кислорода.

Дафний осматривают не менее чем через 24 часа воздействия и повторно через 48 часов, если испытание было продлено.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Постройте график совокупного процента иммобилизации в каждой концентрации после не менее 24 часов воздействия в зависимости от концентрации на бумаге с логарифмической вероятностью. Проведите линию по точкам и определите концентрацию, соответствующую ответу 50 %.

Если данные адекватны, медианную концентрацию и ее доверительные пределы (p = 0,05) можно оценить с использованием стандартных процедур.

Значение EC50 следует округлить до одной (или максимум двух) значащих цифр.

В тех случаях, когда наклон кривой реакции концентрации/процента слишком крутой, чтобы можно было рассчитать EC50, графической оценки этого значения достаточно.

Когда две последовательные концентрации при соотношении 1,8 дают только 0 и 100% иммобилизацию, этих двух значений достаточно, чтобы указать диапазон, в который попадает EC50.

Если обнаруживается, что стабильность или гомогенность испытуемого вещества не могут быть сохранены, то следует соблюдать осторожность при интерпретации результатов и об этом следует сообщить.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Отчет об испытаниях должен, если возможно, содержать: - информацию об тестируемом организме (научное название, штамм; поставщик или источник, любая предварительная обработка, метод разведения, включая источник, вид и количество пищи, частоту кормления),

- количество дафний, использованных в каждой исследуемой концентрации,

- список используемых концентраций и любую доступную информацию о стабильности концентраций испытуемого химического вещества в испытуемом растворе,

- описание тестовых сосудов, объемы раствора в каждом, количество животных в каждом сосуде,

- если проводятся химические анализы, использованные методы и результаты,

- источник разбавляющей воды и основные химические характеристики,

- способ приготовления исходных и тестовых растворов,

- концентрации любых используемых вспомогательных веществ (органических растворителей, диспергаторов и т. д.),

- световой режим,

- самая высокая тестируемая концентрация, не вызывающая иммобилизации в течение периода испытания,

- наименьшая тестируемая концентрация, вызывающая 100% иммобилизацию в течение периода испытания,

- кумулятивную иммобилизацию в холостом опыте, в контроле со вспомогательным веществом и в каждой тестируемой концентрации в рекомендуемые сроки наблюдения (24 часа или 24 и 48 часов),

- значения EC50 в каждый из рекомендуемых периодов наблюдения (с доверительным интервалом 95 %, если возможно),

- график кривой реакции концентрация/процент в конце теста,

- статистические процедуры, используемые для определения значений EC50,

- если возможно, наклон кривой реакции концентрации/процента через 24 часа и ее доверительные пределы 95 %,

- концентрация растворенного кислорода, значения pH, температура тестируемых растворов,

- если используется эталонное вещество, необходимо указать его название и полученные результаты,

- доказательства того, что критерии качества были выполнены.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методические указания 202, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ISO Ингибирование подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera - ракообразные) ISO/6341.

(3) AFNOR Ингибирование подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera - ракообразные) NFT 90 301 (апрель 1974 г.).

(4) Процедуры испытаний DIN с водными организмами 38412 (L1) и (L11).

Приложение Восстановленная вода

Пример подходящей воды для разбавления

Все химические вещества должны быть аналитической степени чистоты.

Вода должна быть дистиллированной или деионизированной водой хорошего качества с проводимостью менее 5 Смм-1.

Стандартные решения >PIC FILE= "T0027407">

Восстановленная вода для разбавления

Смешайте по 25 мл каждого из четырех исходных растворов и доведите до 1 литра водой.

Аэрируйте до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не сравняется со значением насыщения воздуха.

Уровень pH должен составлять 7,9±0,3. При необходимости отрегулируйте pH с помощью NaOH (гидроксида натрия) или HCl (соляной кислоты).

Приготовленную таким образом воду для разбавления оставляют примерно на 12 часов, и ее дальнейшая аэрация не требуется.

Сумма ионов Ca и Mg в этом растворе составляет 2,5 ммоль на литр. Соотношение ионов Са:Mg составляет 4:1, ионов Na:K — 10:1. Общая щелочность этого раствора составляет 0,8 ммоль на литр.

Любые отклонения в приготовлении воды для разбавления не должны изменять состав или свойства воды.

C. 3. ДЕГРАДАЦИЯ БИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ: МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СКРИНИНГОВЫЙ ТЕСТ ОЭСР

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение биоразлагаемости водорастворимых нелетучих органических соединений в аэробной водной среде при начальной исследуемой концентрации, соответствующей от 5 до 40 мг DOC (растворенного органического углерода) на литр. Если пределы обнаружения анализаторов органического углерода будут улучшены, использование более низких тестовых концентраций может оказаться выгодным, особенно для токсичных соединений. Должно быть установлено содержание органического углерода в испытуемом материале.

Метод применим только к тем органическим испытуемым материалам, которые в концентрации, используемой в тесте: - являются, по меньшей мере, водорастворимыми в испытуемой концентрации (от 5 до 40 мг DOC на литр);

- имеют незначительное давление пара,

- не подавляют бактерии,

- не сильно адсорбируются на стеклянных поверхностях.

Информация об относительных пропорциях основных компонентов исследуемого материала будет полезна при интерпретации полученных результатов, особенно в тех случаях, когда результаты низкие или маргинальные.

Информация о токсичности химического вещества для микроорганизмов может быть полезна для интерпретации заниженных результатов и выбора подходящих тестовых концентраций.

1.2. Определения и единицы измерения

Деградация определяется как процент удаления DOC по отношению к испытуемому материалу: >PIC FILE="T0027408">

где:

Dt = деградация в процентах удаления DOC в момент времени t,

C0 = начальная концентрация DOC в культуральной среде (мг DOC на литр),

Ct = концентрация DOC в культуральной среде в момент времени t (мг DOC на литр),

Cbl(0) = начальная концентрация DOC в контрольном материале (мг DOC на литр),

Cbl(t) = концентрация DOC в контрольном материале в момент времени t (мг DOC на литр).

1.3. Эталонные вещества

Для проверки активности инокулята желательно использовать подходящие контрольные химикаты. >ФАЙЛ ПИК="T0027409">

1.4. Принцип метода испытаний

Заранее определенное количество соединения растворяют в неорганической среде (минеральный питательный раствор, обогащенный микроэлементом и раствор незаменимых витаминов), обеспечивая концентрацию, соответствующую от 5 до 40 мг DOC на литр. Раствор инокулируют небольшим количеством микроорганизмов из смешанной популяции и аэрируют при температуре 20–25 °C в темноте или, по крайней мере, только при рассеянном свете.

За разложением следят анализы DOC в течение 28-дневного периода.

Процедуру проверяют с помощью контрольного вещества.

Контрольный образец DOC должен определяться в параллельном тесте, не содержащем ни тестируемого, ни контрольного материала.

1,5. Критерии качества

Воспроизводимость метода была подтверждена кольцевыми тестами ОЭСР и ЕЭС.

Самая низкая концентрация тестируемого соединения, для которой может быть использован этот метод, в значительной степени определяется пределом обнаружения анализа органического углерода (0,5 мг углерода на литр на современном уровне техники) и концентрацией растворенного органического углерода в питательный раствор.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Вода

Деионизированная или дистиллированная вода, не содержащая токсичных веществ (в частности, меди), для общего использования в качестве растворителя. Пригодна вода, деионизированная дистилляцией или ионным обменом.

Дистиллированная вода не должна содержать более 10 % органического углерода, вносимого испытуемым материалом.

Вода высокой чистоты необходима с учетом анализа DOC в диапазоне концентраций от 0 до 40 мг на литр. Загрязнения возникают как из-за внутренних примесей, так и из-за ионообменных смол и развития микробов (бактерии, водоросли под воздействием света и т. д.). Для одной серии испытаний должна использоваться только одна партия воды, которая должна быть предварительно проверена с помощью анализа DOC. При необходимости подходящую воду можно получить УФ-облучением или другими способами.

1.6.1.2. Питательный раствор

Питательный раствор содержит по 1 мл каждого из следующих растворов от (a) до (f) в воде (1.6.1.1.) (AR означает аналитический реагент): >PIC FILE= "T0027410">

>ФАЙЛ ПИК="T0027411">

Раствор фильтруют стерильно через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Вместо раствора 1.6.1.2 (е) допускается использовать 15 мг дрожжевого экстракта на 100 мл воды (1.6.1.1).

1.6.1.3. Контрольные вещества

Анилин (свежеперегнанный), ацетат натрия, бензоат натрия.

1.6.1.4. Раствор хлорида ртути

1 % HgCl2 в воде (1.6.1.1).

1.6.2. Аппарат 1.6.2.1. Встряхивающая машина, вмещающая 2-литровые колбы Эрленмейера, с автоматическим контролем температуры или используемая в помещении с постоянной температурой от 20 до 25 °C.

1.6.2.2. 2-литровые колбы Эрленмейера с узким горлом (рекомендуются колбы со складками или рифлеными). Перед использованием колбы необходимо тщательно очистить, например, спиртовой соляной кислотой, прополоскать и высушить во избежание загрязнения остатками предыдущих испытаний. Колбы также необходимо очистить перед первым использованием, поскольку они могут быть загрязнены.

1.6.2.3. Мембранный фильтрационный аппарат.

1.6.2.4. Мембранные фильтры 0,2 ¶м.

1.6.2.5. Анализатор углерода.

1.6.3. Приготовление инокулята

В качестве инокулята можно использовать любой из следующих четырех источников при условии, что его жизнеспособность проверена с помощью контрольного вещества (1.6.1.3). 1.6.3.1. Инокулят из вторичных сточных вод

Инокулят предпочтительно получают из вторичных сточных вод хорошего качества, собранных на очистных сооружениях, работающих преимущественно с бытовыми сточными водами. Сточные воды должны храниться в аэробных условиях в период между отбором проб и использованием. Для приготовления посевного материала пробу фильтруют через фильтр грубой очистки, первые 200 мл отбрасывают. Фильтрат остается аэробным до использования. Инокулят необходимо использовать в день сбора.

1.6.3.2. Инокулят из почвы

100 г почвы (плодородной, нестерильной) растворяют в 1000 мл питьевой воды, не содержащей хлора (почвы с очень большим содержанием глины, песка или органического углерода не подходят). После перемешивания суспензии дают отстояться в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр грубой очистки, первые 200 мл отбрасывают. Фильтрат сразу аэрируют и аэрацию продолжают до использования. Инокулят необходимо использовать в день сбора.

1.6.3.3. Инокулят из поверхностных вод

Инокулят берут из подходящей поверхностной воды. Пробу фильтруют через бумажный фильтр грубой очистки, первые 200 мл отбрасывают. Фильтрат остается аэробным до использования. Инокулят необходимо использовать в день сбора.

1.6.3.4. Композитный инокулят

Равные объемы трех образцов инокулята хорошо перемешивают и из этой смеси отбирают окончательный инокулят.

Пригодность инокулята проверяют с помощью контрольного вещества (1.6.1.3).

1.6.4. Тестовая процедура

Испытуемые материалы оценивают одновременно в двух экземплярах вместе с контрольным веществом (1.6.1.3). Также проводят холостой тест с инокулятом, но без тестируемого или контрольного материала для определения холостого содержания DOC.

Готовят исходный раствор испытуемого материала в воде (1.6.1.1). Некоторое количество этого исходного раствора добавляют к питательному раствору (1.6.1.2) так, чтобы концентрация углерода составляла от 5 до 40 мг DOC на литр. Контрольный материал (1.6.1.3) испытывают при начальной концентрации, соответствующей 20 мг DOC на литр.

По 900 мл питательного раствора помещают в два реакционных сосуда (1.6.2.2) и засевают порциями по 0,5 мл на литр инокулята (1.6.3). Отверстие сосуда закрывается, например, алюминиевой фольгой таким образом, чтобы обмен воздуха между колбой и окружающей атмосферой не был чрезмерно затруднен (вата непригодна из-за анализа DOC). Затем сосуды помещают в встряхивающую машину. Во время испытания температуру следует поддерживать в пределах от 20 до 25 °С, а сосуды следует защищать от света. Воздух не должен содержать загрязняющих веществ и токсичных материалов (хлорированных растворителей и т. д.).

В ходе испытания на биоразложение концентрации DOC определяются дважды в первый день, а также на 27 и 28 дни. Необходимо провести не менее трех дополнительных анализов (примерно на седьмой, 14 и 21 день), чтобы проследить за ходом теста. деградация.

Для каждого определения можно брать только необходимые объемы питательной среды. Центрифугирование или мембранная фильтрация, предшествующие фактическому определению углерода, требуют разных объемов для разных инструментов. Потери питательной среды от испарения восполняют добавлением воды (1.6.1.1) в необходимом количестве. Культуральную среду следует тщательно перемешать перед отбором пробы. Перед отбором проб материал, прилипший к стенкам сосуда, должен быть растворен или суспендирован. Мембранную фильтрацию или центрифугирование необходимо провести немедленно. Отфильтрованные или центрифугированные пробы должны быть проанализированы в тот же день, в противном случае их необходимо консервировать с помощью 0,05 мл раствора HgCl2 (1.6.1.4) на каждые 10 мл питательной среды или хранить при температуре от 2 до 4 °С. до 24 часов или ниже - 18 °C в течение более длительного периода времени.

Если плато наблюдается до 28-го дня, тест можно заканчивать. Если деградация явно началась к 28-му дню, но не достигла плато, считается хорошей практикой продлить эксперимент еще на одну-две недели.

Все этапы требуют большой осторожности и должны быть обеспечены чистота сосудов, пипеток и т. д. (но не стерильность).

1.6.5. Определения DOC

Мембранные фильтры подходят, если есть уверенность в том, что они не выделяют углерод и не адсорбируют вещества на этапе фильтрации. >ФАЙЛ ПИК="T0027412">

Примечание >ФАЙЛ PIC="T0027413">

Пробу, отобранную для культуральной среды (около 30 мл), центрифугируют или мембранно фильтруют сразу в фильтровальном аппарате (1.6.2.3) с использованием мембранных фильтров по 1.6.2.4. Первые 20 мл фильтрата отбрасывают.

Концентрацию РОУ определяют дважды в оставшемся фильтрате (около 10 мл) с помощью прибора ТОС/ДОУ (1.6.2.5). Если фильтрат не может быть проанализирован в тот же день, его необходимо законсервировать в соответствии с пунктом 1.6.4.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Результаты анализа оформляют в прилагаемом бланке (приложение 1), а значения биодеградации рассчитывают согласно 1.2.

Концентрации DOC рассчитываются с точностью до 0,1 мг на литр. Средние значения Dt округляются до ближайшего целого процента.

Ход испытания на деградацию прослеживается графически на диаграмме, как показано в прилагаемом примере (Приложение 2). >ФАЙЛ ПИК="T0027414">

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Протоколы испытаний

Протокол испытаний должен, если возможно, содержать следующее: >PIC FILE="T0027415">

>ФАЙЛ ПИК="T0027416">

3.2. Интерпретация результатов

Из-за строгости этого теста низкий результат не обязательно означает, что испытуемое соединение не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывает на то, что для установления этого потребуется дополнительная работа.

Испытуемые химические вещества, показавшие высокую потерю DOC в этом тесте, следует рассматривать как легко биоразлагаемые при условии, что этот уровень достигается в течение 10-дневного интервала, считая со дня, когда наблюдаемый уровень биоразложения впервые превышает 10%.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 301E, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) Герике, П., Фишер, В.К., Корреляционное исследование определения биоразлагаемости с различными химическими веществами в различных тестах, Экотоксикология и экологическая безопасность, том. 3, № 2, 1979, стр. 159–173.

(3) Герике П., Фишер В.К. Корреляционное исследование определения биоразлагаемости различных химических веществ в различных испытаниях II. Дополнительные результаты и выводы // Экотоксикология и экологическая безопасность. 5, № 1, 1981, стр. 45–55.

Приложение 1

Биотическая деградация: модифицированный скрининговый тест ОЭСР

>ФАЙЛ ПИК="T0027417">

Биотическая деградация: модифицированный скрининговый тест ОЭСР (форма)

>ФАЙЛ ПИК="T0027418">

Приложение 2

>ФАЙЛ ПИК="T0027419">

>ФАЙЛ ПИК="T0027420">

C. 4. ДЕГРАДАЦИЯ БИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ: МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТЕСТ AFNOR NF T 90/302.

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение биоразлагаемости водорастворимых нелетучих органических соединений в аэробной водной среде при начальной исследуемой концентрации, соответствующей 40 мг DOC (растворенного органического углерода) на литр. Если пределы чувствительности анализаторов органического углерода будут улучшены, использование более низких тестовых концентраций может оказаться выгодным, особенно для токсичных соединений.

Должно быть установлено содержание органического углерода в испытуемом материале.

Метод применим только к тем органическим испытуемым материалам, которые в концентрации, используемой в тесте: - являются, по меньшей мере, водорастворимыми в испытуемой концентрации (40 мг DOC на литр);

- иметь незначительное давление пара,

- не подавляют бактерии,

- не сильно адсорбируются на стеклянных поверхностях.

Информация об относительных пропорциях основных компонентов исследуемого материала будет полезна при интерпретации полученных результатов, особенно в тех случаях, когда результаты низкие.

Информация о токсичности химического вещества для микроорганизмов может быть полезна для интерпретации заниженных результатов.

1.2. Определения и единицы измерения

Деградация определяется как процент удаления DOC по отношению к испытуемому материалу: >PIC FILE="T0027421">

где:

Dt = деградация в процентах удаления DOC в момент времени t,

C0 = начальная концентрация DOC в культуральной среде (мг DOC на литр),

Ct = концентрация DOC в культуральной среде в момент времени t (мг DOC на литр),

Cbl(0) = начальная концентрация DOC в контрольном материале (мг DOC на литр),

Cbl(t) = концентрация DOC в контрольном материале в момент времени t (мг DOC на литр).

1.3. Эталонные вещества

Для проверки активности инокулята желательно использовать подходящие контрольные химикаты. >ФАЙЛ ПИК="T0027422">

специально для ингибирующего теста и для проверки активности инокулята, которую также можно проверить с помощью анилина, ацетата натрия и бензоата натрия.

1.4. Принцип метода испытаний

Органические вещества, растворенные в воде, биоразлагаются хемиорганотрофными микроорганизмами, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти продукты изучаются в такой концентрации, при которой исходное содержание органического углерода составляет 40 мг на литр. Органический углерод, оставшийся в растворе, измеряют не менее чем через три, семь, 14 и 28 дней. Одновременно тестируемое вещество проверяется на возможное ингибирующее воздействие на инокулят.

Процедуру проверяют с помощью контрольного вещества.

1,5. Критерии качества

Воспроизводимость метода была подтверждена кольцевыми тестами ОЭСР и ЕЭС.

Самая низкая концентрация испытуемого соединения, для которой может быть использован этот метод испытаний, в значительной степени определяется пределом чувствительности анализа органического углерода (0,5 мг углерода на литр на современном уровне техники) и концентрацией растворенного органического углерода. в питательном растворе.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты

Используемые химические вещества должны иметь аналитическую чистоту. 1.6.1.1. Дистиллированная вода

Дистиллированная вода не должна содержать более 10 % органического углерода, внесенного испытуемым материалом.

1.6.1.2. Питательный раствор

Подготовьте тестовую среду, как указано ниже, используя стерильные материалы. На один литр раствора растворите в дистиллированной воде следующее (AR означает аналитический реагент): >PIC FILE="T0027423">

>ФАЙЛ ПИК="T0027424">

Дистиллированная вода до 100 мл

(Раствор микроэлемента можно хранить в течение одного месяца при температуре от + 1 до + 4 °С.)

Доведите до объема (1 литр) и перемешайте. Среду необходимо использовать в течение 12 часов.

1.6.1.3. Контрольные вещества

Анилин (свежеперегнанный), ацетат натрия, бензоат натрия, глюкоза.

1.6.2. Аппарат

Обычное лабораторное оборудование и: - аппаратура для анализа органического углерода,

- спектрофотометр,

- центрифуга 4 000 г,

- шейкер, обеспечивающий достаточную аэрацию и встряхивание,

- аппарат для определения растворенного кислорода, рН-метр, стерильные широкогорлые конические колбы емкостью 500 мл,

- аппараты для стерильной фильтрации (мембранные фильтры пористостью 0,22 мкм).

Стеклянная посуда должна быть тщательно очищена и полностью очищена от следов органических и токсичных веществ.

1.6.3. Приготовление инокулята

Отберите соответствующий объем смеси трех проб загрязненных поверхностных вод и сточных вод городских очистных сооружений, свободных от основных специфических загрязнителей. Количество бактерий в каждом образце должно составлять не менее 105 бактерий/мл.

Пробы должны быть использованы для инокуляции в течение 12 часов, включая транспортировку, и не должны оставаться более шести часов без аэрации.

Фильтруют через бумагу для удаления более крупных нерастворимых частиц, собирают фильтрат и пропускают через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Промыть любым подходящим изотоническим раствором. Бактерии, осевшие на мембранном фильтре, поглотите небольшим объемом любого изотонического раствора. Хорошо перемешать. Измерьте поглощение при 620 нм и на основании этого определите концентрацию бактерий по отношению к стандартной кривой, полученной ранее посредством подсчета на твердой среде штамма Pseudomonas fluorescens ATCC 15453. Добавьте объем раствора, необходимый для доведения концентрации бактерий до 5 ± 3 × 107/мл. Используйте инокулят в течение следующего часа.

1.6.4. Тестовая процедура

Инкубацию следует проводить при отсутствии интенсивного освещения, в инкубаторе, поддерживающем температуру от 20 до 25 °C и защищенном от токсичных паров.

Приготовьте следующие растворы: 1. Раствор испытуемого вещества в испытуемой среде таким образом, чтобы получить концентрацию органического углерода 40 мг на литр.

2. Раствор глюкозы в исследуемой среде таким образом, чтобы получить концентрацию органического углерода 40 мг на литр.

3. Раствор, содержащий в тестируемой среде используемые концентрации тестируемого вещества и глюкозы.

4. Также подготовьте достаточный объем тестовой среды.

Смешайте четыре раствора по отдельности и стерилизуйте фильтрованием через мембранный фильтр.

Мембранные фильтры подходят, если есть уверенность в том, что они не выделяют углерод и не адсорбируют вещества на этапе фильтрации.

Все необходимые манипуляции необходимо проводить стерильными методами. Распределите растворы по тестовым колбам (предварительно простерилизованным) по следующей схеме: >PIC FILE="T0027425">

Засевают флаконы 1, 2, 3, 5, 6 и 7 по 1,5 мл инокулята и хорошо перемешивают ручным встряхиванием.

Возьмите аликвоту от 3 до 5 мл из каждой колбы.

Центрифугируйте аликвоты при 4000 g в течение 15 минут, поддерживая температуру ниже 26 °C.

Соберите супернатанты для анализа органического углерода во время 0.

Поместите колбы на шейкер и оставляйте их там на протяжении всего периода испытания: концентрация растворенного кислорода на 3-й день в колбе 5 должна быть не менее 5 мг на литр.

Так же, как и для анализа органического углерода в момент времени 0, проведите этот анализ в колбах 1, 2, 3, 5, 6 и 7 после не менее трех, семи, 14, 28 дней инкубации. Однако если снижение содержания углерода достигнет 95 % от исходного содержания в колбах 1, 2 и 3, испытание считают оконченным.

Тест можно завершить до 28-го дня, если плато наблюдается раньше.

Если деградация явно началась к 28-му дню, но не достигла плато, считается хорошей практикой продлить эксперимент еще на одну-две недели.

В конце теста проводят анализ органического углерода в колбе 4 таким же образом, как и в момент 0, и проверяют стерильность путем посева в пробирку с жидкой культуральной средой и инкубации при 25°С в течение пяти дней.

Культуральная среда: >PIC FILE="T0027426">

Компоненты обезвоженной полной среды растворяют в кипящей воде. При необходимости отрегулируйте pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 7,2 ± 0,2 при 20 °C.

Если анализы на содержание органического углерода необходимо отложить, надосадочную жидкость хранят при температуре 4°С в темноте в герметично закрытых стеклянных колбах; максимально допустимая продолжительность консервации — 24 часа. Если анализ невозможно провести в течение 24 часов, то замораживают при температуре ниже -18°С.

Для компенсации потерь воды за счет испарения перед каждым отбором проб проверяют объем среды в колбе и при необходимости дополняют объем дистиллированной водой, простерилизованной фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм для восстановления. объем, измеренный после предыдущего отбора проб.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Результаты анализа записывают в прилагаемую форму (приложение 1) и рассчитывают значения биоразложения согласно 1.2.

Результаты теста на деградацию действительны, если соблюдаются условия: - уровень деградации глюкозы в колбе 5 должен составлять не менее 80 % к 7-му дню,

- что по окончании теста колба 4 должна оставаться стерильной,

- что концентрация растворенного кислорода на 3-й день в колбе 5 должна быть не менее 5 мг/л.

Уровень биодеградации глюкозы в колбе 6 должен к 7-му дню составлять не менее 75 % от наблюдаемого в колбе 5. Если этот предел не достигнут, можно предположить, что испытуемое вещество, подвергнутое испытанию, оказывает ингибирующее действие по отношению к бактериям. присутствует и поэтому метод неприменим в указанной концентрации.

Примечания

Сравнение процентного удаления углерода в колбах 1, 2 и 3, с одной стороны, и в колбе 4, с другой стороны, позволяет дифференцировать причины наблюдаемой деградации: - физико-химический механизм в колбе 4,

- физико-химические плюс биологические механизмы в колбах 1, 2 и 3.

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Все результаты экспериментов, касающиеся испытуемого вещества, эталонного вещества и холостого образца, должны быть зафиксированы.

В частности, укажите следующие моменты: - степень исчезновения продукта в колбе 4 в конце испытания,

- любые наблюдаемые явления торможения,

- подтверждение действительности,

- ход испытания на деградацию представлен графически на диаграмме, показывающей фазу задержки, фазу деградации, наклон и временное окно («временное окно» здесь означает 10-дневный период, начиная со дня, когда наблюдаемый уровень биодеградации впервые превышает 10 %).

3.2. Интерпретация результатов

Из-за строгости этого теста низкий результат не обязательно означает, что испытуемое соединение не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывает на то, что для установления этого потребуется дополнительная работа.

Испытуемые химические вещества, дающие высокий результат потери DOC в этом тесте, следует рассматривать как легко биоразлагаемые при условии, что этот уровень достигается в течение 10 дней, считая со дня, когда наблюдаемый уровень биоразложения впервые превысит 10%.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 301А, Решение Совета C(81) 30 окончательный.

(2) Герике П., Фишер. У.К., Корреляционное исследование определения биоразлагаемости различных химических веществ в различных испытаниях, Экотоксикология и экологическая безопасность, том. 3, № 2, 1979, стр. 159–173.

(3) Герике П., Фишер В.К. Корреляционное исследование определения биоразлагаемости различных химических веществ в различных испытаниях. II. Дополнительные результаты и выводы // Экотоксикология и экологическая безопасность. 5, № 1, 1981, стр. 45–55.

(4) Афнор, Метод оценки в водной среде биоразлагаемости так называемых «суммарных» органических продуктов, Т 90-302.

Приложение 1

Форма модифицированного теста Афнор

>ФАЙЛ ПИК="T0027427">

Приложение 2

>ФАЙЛ ПИК="T0027428">

>ФАЙЛ ПИК="T0027429">

C. 5. ДЕГРАДАЦИЯ БИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ – МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТЕСТ ШТУРМ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение биоразлагаемости нелетучих органических веществ в аэробной водной среде при двух стартовых тестовых концентрациях 10 и 20 мг на литр (стандартные концентрации).

Должно быть доступно содержание органического углерода в испытуемом материале (анализ TOC или оценка с использованием эмпирической формулы, позволяющей рассчитать теоретический выход CO2).

Метод применим только к тем органическим испытуемым материалам, которые при используемой в испытании концентрации: - имеют незначительное давление пара;

- не подавляют бактерии.

Этот метод можно, по крайней мере в принципе, применять к веществам, нерастворимым в исследуемых концентрациях.

Информация об относительных пропорциях основных компонентов исследуемого материала будет полезна при интерпретации полученных результатов, особенно в тех случаях, когда результаты низкие.

Информация о токсичности химического вещества для микроорганизмов может быть полезна для интерпретации заниженных результатов и выбора подходящих тестовых концентраций.

1.2. Определения и единицы измерения

Разложение определяется как количество CO2, выделяемого веществом, в процентах от теоретического количества CO2, которое оно должно было произвести (ThCO2), рассчитанного на основе содержания органического углерода в веществе.

1.3. Эталонные вещества

Для проверки активности инокулята желательно использовать подходящий контрольный химикат. >PIC-ФАЙЛ="T0027430">

1.4. Принцип метода испытаний

Испытуемый материал добавляется в жидкую среду определенного химического состава, инокулированную микроорганизмами из сточных вод и аэрированную при температуре от 20 до 25 °C. Температура регистрируется в течение периода испытаний.

Высвободившийся CO2 улавливается в виде BaCO3, а разложение отслеживается анализом CO2 в течение 28-дневного периода. После сравнения с подходящим холостым контролем общее количество CO2, произведенное испытуемым соединением, определяется за период испытания и рассчитывается как процент от общего количества CO2, которое испытуемый материал, исходя из содержания в нем углерода, теоретически мог бы произвести. .

Процедуру проверяют с помощью посевного контрольного вещества (см. 1.6.1.3).

1,5. Критерии качества

Воспроизводимость метода была подтверждена кольцевыми тестами ОЭСР и ЕЭС.

Эндогенное производство CO2 инокулята, измеренное в пустой колбе, является основной причиной, по которой нельзя использовать концентрацию тестируемого вещества ниже 5 мг на литр. (Когда тест адаптирован к тестируемому веществу, меченному 14C, концентрация может быть намного ниже.)

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Вода высокого качества (HQW) >PIC FILE="T0027431">

1.6.1.2. Питательный раствор (a) Исходный раствор >PIC FILE="T0027432">

(б) Тестовая среда

Испытательная среда должна содержать на литр воды (1.6.1.1) следующие реагенты: - 4 мл вышеуказанного раствора хлорида железа,

- 1 мл вышеуказанного раствора сульфата магния,

- 1 мл вышеуказанного раствора хлорида кальция,

- 2 мл вышеуказанного раствора фосфата,

- 1 мл вышеуказанного раствора сульфата аммония.

Значение pH должно составлять 7,2±0,2.

1.6.1.3. Контрольные вещества

Анилин (свежеперегнанный), ацетат натрия, бензоат натрия.

1.6.1.4. Гидроксид бария 0,025 Н (0,0125 М)

Растворите 4,0 г Ba(OH)2·78H2O на литр HQW. Профильтруйте через фильтровальную бумагу и закройте прозрачный раствор, чтобы предотвратить поглощение CO2 из воздуха. При запуске серии разумно готовить более 5 литров за раз.

1.6.2. Аппарат 1.6.2.1. Устройство для очистки CO2

Серия из 12 бутылей (три тестовых материала). («Carboy» здесь означает бутылку из коричневого стекла емкостью от 4 до 5 литров. Если используются прозрачные стеклянные контейнеры, тест необходимо проводить в темноте.)

Четыре пластиковые бутылки емкостью 1 литр, содержащие 700 мл 10 Н (10 М) NaOH.

Одна колба Эрленмейера емкостью 1 л, содержащая 700 мл 0,025 Н (0,0125 М) раствора (Ba(OH)2).

Один пустой 1-литровый флакон Эрленмейера для предотвращения выноса жидкости.

Эти бутылки последовательно подключаются с помощью инертных трубок к источнику воздуха под давлением, и воздух барботируется через очищающие растворы с постоянной скоростью.

К каждому дополнительному набору из четырех бутылей добавьте еще одну пластиковую бутылку емкостью 1 литр, содержащую 700 мл 10 N (10 M) NaOH.

1.6.2.2. Аппарат для производства CO2

Четыре коричневые бутыли емкостью 4–5 литров для каждого исследуемого материала. Пробки, гибкие трубки, пластиковые трубки.

1.6.2.3. Бутылки с абсорбером CO2

Бутылки с абсорбером гидроксида бария емкостью 100 мл.

1.6.3. Приготовление инокулята

Источником тест-организмов является активный ил, только что отобранный на хорошо функционирующей городской очистной станции. Эта установка по очистке сточных вод не должна получать или не должна получать сточные воды от промышленности.

По прибытии в лабораторию активный ил аэрируется в течение четырех часов. Отбирают пробу 500 мл смешанной жидкости и гомогенизируют ее в течение двух минут механическим блендером. Затем его отстаивают в течение 30 минут.

Если по истечении 30 минут супернатант все еще содержит высокие уровни твердых частиц ила, его можно отстоять еще на 30–60 минут или адаптировать к лабораторным условиям, чтобы улучшить его способность к осаждению.

Надосадочную жидкость декантируют, чтобы обеспечить достаточный объем для 1% инокулята в каждой колбе для анализа CO2. Избегайте переноса твердых частиц ила, которые могут помешать измерению производства CO2.

Хотя это и необязательно, полезно провести подсчет жизнеспособных фракций надосадочной жидкости для определения количества микроорганизмов. Этот инокулят обычно должен содержать от 106 до 20 × 106 колониеобразующих единиц на миллилитр.

Его следует использовать в день приготовления.

1.6.4. Процедура испытания 1.6.4.1. Основной раствор

Исходный маточный раствор испытуемого вещества готовят растворением в воде высокого качества до концентрации 1000 мг на литр.

Исходные растворы готовятся на основе содержания органического углерода в испытуемом материале. Если это неизвестно, исходные растворы готовят до концентрации по весу. Для получения однородной пробы необходимо хорошо перемешать, избегая в то же время пенообразования, которое может привести к концентрации испытуемого вещества. Для твердых проб может потребоваться расплавить и перемешать все содержимое бутыли с образцом перед взятием аликвоты. Эта часть процедуры чрезвычайно важна, поскольку расчет процента биоразложения зависит от наличия правильного количества углерода в тест-системе.

Нет необходимости корректировать pH исходного раствора, если он не выходит за пределы диапазона от 3 до 10, поскольку его будет контролировать фосфатный буфер в тестируемой среде. Если pH выходит за пределы этого диапазона, доведите аликвоту исходного раствора до pH 7,0 ± 1,0 с помощью 1 н. (1 М) HCl или NaOH, следя за тем, чтобы раствор тщательно перемешивался во время добавления кислоты или основания.

Чтобы подтвердить номинальную концентрацию органического углерода испытуемого соединения, исходный препарат (или нейтрализованную аликвоту) можно проанализировать на общее содержание органического углерода. Анализ TOC также необходим для контрольного исходного раствора.

Если испытуемый материал нерастворим в воде, добавьте соответствующее количество испытуемого материала непосредственно в бутыль по весу или объему.

Если испытуемый материал не растворяется при испытуемой концентрации, для достижения хорошей дисперсии испытуемого материала могут потребоваться специальные меры, такие как использование ультразвукового диспергирования.

1.6.4.2. Условия

Поскольку в тесте CO2 используется 1%-ный инокулят, необходимо проводить разведения в тестовой среде CO2.

Этого легче всего достичь следующим образом: (a) в каждую из 4-5-литровых испытательных бутылей добавить 2470 мл высококачественной воды (HQW см. 1.6.1.1);

(b) в каждую из 4-5-литровых бутылей для испытаний добавьте по 3 мл исходных растворов сульфата аммония, сульфата магния и хлорида кальция, добавьте 6 мл исходного фосфатного буферного раствора и 12 мл хлорида железа. решение;

(c) в каждую из 4-5-литровых тестовых бутылей добавьте 30 мл инокулята активного ила.

Эту смесь аэрируют воздухом, не содержащим CO2, в течение 24 часов для очистки системы от углекислого газа.

После периода аэрации 100 мл 0,025 Н (0,0125 М) Ba(OH)2 вводят в каждую из трех бутылей с абсорбером CO2 и последовательно подключают к выходному воздуховоду каждой испытательной бутыли.

1.6.4.3. Производительность теста

Испытательный материал добавляется в две из четырех бутылей, чтобы начать период испытаний. Каждый материал тестируется в двух концентрациях: 10 и 20 мг на литр.

Количество исходного раствора тестируемого материала, необходимое в бутыли, рассчитывается следующим образом: >PIC FILE="T0027433">

где:

B = концентрация тестируемого вещества в тестовой бутыли (миллиграммы на литр),

A = концентрация испытуемого вещества в маточном растворе (миллиграммы на литр),

C = конечный объем тестируемой среды в тестовой бутыли (миллилитры).

В соответствующие бутыли добавляют достаточное количество исходного раствора для достижения желаемой концентрации теста, рассчитанной выше, а также достаточное количество дистиллированной воды для получения 473 мл (исходный раствор + HQW). В третью бутыль, используемую в качестве холостого контроля и не содержащую испытуемого материала, добавляют 473 мл HQW. Конечный объем каждой бутыли теперь составляет 3 000 мл.

В последнюю из четырех бутылей добавляют контрольное вещество в концентрации 20 мг на литр.

Испытание начинают с барботирования раствора воздухом, не содержащим CO2, со скоростью от 50 до 100 мл в минуту на бутыль (= один-два пузырька в секунду).

Нерастворимые в воде тестируемые материалы можно добавлять в сухом виде в бутыль для анализа CO2 и перемешивать магнитной мешалкой. Для вспенивающих химикатов барботирование воздуха без CO2 можно заменить аэрацией сверху и магнитным перемешиванием.

CO2, образующийся в каждой бутыли, реагирует с гидроксидом бария и осаждается в виде карбоната бария; количество образовавшегося CO2 определяют титрованием оставшегося Ba(OH)2 0,05 N (0,05 M) стандартизованной HCl. Периодически (каждые два-три дня) ближайший к бутыли поглотитель CO2 вынимают для титрования. Остальные два поглотителя перемещают каждый на одно место ближе к бутыли, а новый поглотитель, содержащий 100 мл свежего 0,025 Н (0,0125 М) Ba(OH)2, помещают в дальнем конце ряда.

Титрование проводят по мере необходимости (до того, как во второй ловушке появится осадок BaCO3), примерно через день в течение первых 10 дней и каждый пятый день до 28-го дня.

На 27-й день снова измеряют pH содержимого бутылей, а затем в каждую из испытуемых бутылей добавляют по 1 мл концентрированной HCl для удаления неорганического карбоната. Бутыли аэрируют в течение ночи, и из каждой бутыли отбирают образцы для анализа DOC. Окончательное титрование проводят на 28-й день.

Титрование 100 мл раствора Ba(OH)2 производят после удаления бутылей, ближайших к бутылям. Ba(OH)2 титруют 0,05 N (0,05 M) HCl, используя в качестве индикатора фенолфталеин.

Испытание проводится при комнатной температуре от 20 до 25 °C, и температура регистрируется в течение периода испытания.

Если плато наблюдается до 28-го дня, тест можно прекратить.

Если деградация явно началась к 28-му дню, но не достигла плато к 28-му дню, считается хорошей практикой продлить эксперимент еще на одну-две недели.

1.6.5. Определение CO2

Можно рассмотреть другие способы измерения выделения CO2, кроме обратного титрования ловушек Ba(OH)2. Это не меняет принципа данного теста и, возможно, может привести к непрерывному отслеживанию биоразложения по мере его прогрессирования.

Первым шагом в расчете количества произведенного CO2 является поправка на эндогенное производство CO2 в бутылях исследуемого материала. Контрольная бутыль служит «заготовкой для посева» для корректировки содержания CO2, который может образовываться в результате эндогенного дыхания бактерий. Количество CO2, выделяемого исследуемым материалом, определяют по разнице (в миллилитрах титранта) между экспериментальной и контрольной ловушками Ba(OH)2.

При использовании 0,05 Н (0,05 М) HCl для титрования абсорбера каждый миллилитр титруемой HCl соответствует 1,1 мг образовавшегося CO2.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Результаты анализа фиксируют в прилагаемом бланке (см. Приложение 1), а значения биоразложения рассчитывают согласно пункту 1.2.

Концентрации CO2 рассчитываются с точностью до 0,1 мг на литр. Значения биоразложения округлены до целого процента.

Ход испытания на деградацию прослеживается графически на диаграмме, как показано в прилагаемом примере (см. Приложение 2).

Результаты теста на деградацию действительны, если выполнены следующие условия: >PIC FILE="T0027434">

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен, если возможно, содержать следующее: >PIC FILE="T0027435">

3.2. Интерпретация результатов

Из-за строгости этого теста низкий результат не обязательно означает, что испытуемое соединение не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывает на то, что для установления этого потребуется дополнительная работа.

Испытуемые химические вещества, дающие высокий результат биоразложения в этом тесте, следует рассматривать как легко биоразлагаемые при условии, что этот уровень достигается в течение 10-дневного интервала, считая со дня, когда наблюдаемый уровень биоразложения впервые превышает 10 %.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 301B, Решение Совета C(81) 30, окончательное.

(2) Герике, П., Фишер, В.К., Корреляционное исследование определения биоразлагаемости с различными химическими веществами в различных тестах, Экотоксикология и экологическая безопасность, том. 3, № 2, 1979, стр. 159–173.

(3) Герике П., Фишер В.К. Корреляционное исследование определения биоразлагаемости различных химических веществ в различных испытаниях II. Дополнительные результаты и выводы // Экотоксикология и экологическая безопасность. 5, № 1, 1981, стр. 45–55.

(4) Ларсон, Р.Дж., Оценка потенциала биоразложения ксенобиотических органических химикатов, Прикладная и экологическая микробиология, том. 38, 1979, стр. 1153–1161.

Приложение 1

Форма модифицированного теста Штурма

>ФАЙЛ ПИК="T0027436">

Приложение 2

>ФАЙЛ ПИК="T0027437">

>ФАЙЛ ПИК="T0027438">

C.6. ДЕГРАДАЦИЯ БИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ: ИСПЫТАНИЕ В ЗАКРЫТОЙ БУТЫЛКЕ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение биоразлагаемости органических соединений в аэробной, водной среде при испытуемой концентрации от 2 (стандартная концентрация) до 10 мг на литр испытуемого вещества.

На современном этапе разработки этот тест особенно подходит для оценки биоразлагаемости водорастворимых соединений. Однако летучие соединения, а также плохо растворимые соединения также могут, по крайней мере в принципе, быть протестированы.

Эмпирическая формула исследуемого материала необходима для расчета теоретической потребности в кислороде (ThOD); если неизвестно, химическое потребление кислорода (ХПК) испытуемого материала может служить эталонным значением (см. Приложение 1).

Метод применим только к тем органическим испытуемым материалам, которые в концентрации, используемой в тесте, не подавляют рост бактерий. Если испытуемый материал не растворяется при испытуемой концентрации, для достижения хорошей дисперсии испытуемого материала могут потребоваться специальные меры, такие как использование ультразвукового диспергирования.

Информация об относительных пропорциях основных компонентов исследуемого материала будет полезна при интерпретации полученных результатов, особенно в тех случаях, когда результаты низкие.

Информация о токсичности химического вещества для микроорганизмов может быть полезна для интерпретации заниженных результатов и выбора подходящих тестовых концентраций.

Этот метод можно использовать для определения БПК.

1.2. Определения и единицы измерения

Биохимическую потребность в кислороде (БПК) рассчитывают как разницу обеднения кислорода между холостой пробой и раствором испытуемого материала в условиях теста. После деления на концентрацию (мас./об.) вещества получается чистое истощение кислорода в миллиграммах БПК на миллиграмм вещества.

Разложение определяется как отношение биохимической потребности в кислороде либо к теоретической потребности в кислороде (ThOD), либо к химической потребности в кислороде (COD) и выражается в процентах.

Примечание

Иногда два способа расчета (процент ThOD или процент COD) не дают одинаковых результатов. >ФАЙЛ ПИК="T0027439">

где:

ThOD = теоретическая потребность в кислороде (расчет см. в Приложении 1),

ХПК = химическая потребность в кислороде, определенная экспериментально.

1.3. Эталонные вещества

Для проверки активности инокулята желательно использовать подходящие контрольные химикаты. >PIC-ФАЙЛ="T0027440">

1.4. Принцип метода испытаний

Заранее определенное количество соединения растворяют в неорганической среде (минеральном питательном растворе), обеспечивая концентрацию обычно 2 мг испытуемого вещества на литр. В раствор инокулируют небольшое количество микроорганизмов из смешанной популяции и хранят в закрытых флаконах в темноте в бане с постоянной температурой или в закрытом помещении при температуре от 20 до 21 °C.

Разложение сопровождается анализом кислорода в течение 28-дневного периода. Процедуру проверяют с помощью контрольного вещества инокулята.

Кислородный бланк должен определяться в параллельном тесте, не содержащем ни тестируемого, ни контрольного материала.

Одновременно тестируемое вещество может быть проверено на возможное ингибирующее действие на инокулят.

1,5. Критерии качества

Воспроизводимость метода была подтверждена кольцевыми тестами ОЭСР и ЕЭС.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Дистиллированная или деионизированная вода

Вода дистиллированная или деионизированная с содержанием меди не более 0,01 мг/л, насыщенная воздухом. Объем, соответствующий дневной потребности (например, 50 литров), поддерживается при комнатной температуре, максимально близкой к 20 °C, и интенсивно аэрируется в течение 20 минут чистым сжатым воздухом. Как правило, вода готова к использованию после 20-часового стояния при температуре 20 °C. Кислород определяют в целях контроля. Концентрация при 20 °C должна составлять 9,09 мг O2 на литр. Все операции по перекачке и наполнению насыщенной воздухом воды должны выполняться без пузырьков с помощью сифона.

1.6.1.2. Питательный раствор (a) Исходные растворы: >PIC FILE="T0027441">

(б) Тестовая среда:

Испытательная среда должна содержать на литр воды (1.6.1.1) 1 мл каждого из вышеуказанных исходных растворов.

Значение pH должно составлять 7,2±0,2.

1.6.1.3. Контрольные вещества

Анилин (свежеперегнанный), ацетат натрия, бензоат натрия.

1.6.2. Аппарат 1.6.2.1. Можно использовать калиброванные флаконы емкостью 250–300 мл по БПК со стеклянными пробками или некалиброванные флаконы емкостью 250 мл с узким горлышком и стеклянными пробками, объемы которых необходимо определить.

1.6.2.2. Несколько 2-, 3- и 5-литровых бутылей с литровыми отметками для подготовки эксперимента и наполнения БПК бутылей.

1.6.2.3. Пипетки объемом от 1 до 10 мл; воронки и бумажный фильтр грубой очистки; флаконы для приготовления посевного материала.

1.6.2.4. Водяная баня для поддержания постоянной температуры бутылок при исключении света.

1.6.3. Приготовление инокулята

В качестве инокулята можно использовать любой из следующих четырех источников при условии, что его жизнеспособность проверена с помощью контрольного вещества (1.6.1.3). 1.6.3.1. Инокулят из почвы

Водная суспензия неудобренной садовой земли. 100 г садовой земли, которая недавно не удобрялась (особенно предпочтительна почва из теплицы, которая имеет постоянную температуру в течение всего года), растворяют в 1 литре водопроводной воды, не содержащей хлора. Через 30 минут суспензию фильтруют через бумажный фильтр грубой очистки и первые 200 мл фильтрата отбрасывают. Для инокуляции служит следующая основная часть фильтрата (одна капля из заостренной пипетки на литр конечного объема). Посевной материал готовят непосредственно перед экспериментом. Если его предполагается хранить в течение нескольких часов, его необходимо проветривать. Количество бактерий можно определить путем подсчета на чашках или с помощью наборов питательных подушек. На миллилитр конечного объема должно быть не более 103–105 бактерий.

1.6.3.2. Инокулят из вторичных сточных вод

Инокулят желательно готовить на вторичной установке (установке с активным илом или капельном фильтре, работающем преимущественно с бытовыми сточными водами). Сточные воды должны храниться в аэробных условиях в период между отбором проб и применением. Для приготовления инокулята пробу фильтруют через бумажный грубый фильтр, первые 200 мл отбрасывают. Остальная часть фильтрата остается аэробной до использования. Инокулят необходимо использовать в день сбора.

1.6.3.3. Инокулят из лабораторного активного ила

Используются сточные воды из сильноаэрированной лабораторной установки активного ила. Инокулят готовят, как описано в 1.6.3.2.

1.6.3.4. Композитный инокулят

Равные объемы трех образцов инокулята (от 1.6.3.1 до 1.6.3.3) хорошо перемешивают и из этой смеси отбирают окончательный инокулят.

1.6.4. Тестовая процедура

Все необходимые манипуляции перед инкубацией следует проводить при температуре около 20°С.

Для определения БПК испытуемого и контрольного веществ в одновременных сериях экспериментов готовят группы бутылей (1.6.2.1) (см. приложение 2). Если химические анализы проводятся одновременно, необходимо подготовить достаточное количество бутылей, включая контрольные образцы для инокулята и бланка. Для одного испытуемого материала для испытаний через 0, 5, 15 и 28 дней готовят семь или 15 параллельных бутылей после приготовления достаточного объема воды в больших бутылях (1.6.2.2).

Эти бутыли сначала наполняют примерно на одну треть объема дистиллированной водой (1.6.1.1) с помощью сифона. Затем в эти бутыли пипеткой вносят отдельные исходные растворы солей (1.6.1.2) в соответствии с конечным объемом и добавляют соответствующие исследуемые или контрольные вещества в таких количествах, чтобы достигались конечные концентрации 2, а иногда и 5 или 10 мг на литр. .

Концентрация около 9 мг растворенного кислорода на литр воды для разбавления при 20 °C ограничивает возможную начальную концентрацию испытуемого материала примерно до 2 мг на литр, чтобы гарантировать значительную концентрацию кислорода, остающуюся после окисления испытуемого субстрата.

Плохо разлагаемые вещества или вещества с низким значением ThOD предпочтительно тестировать параллельно при более высоких концентрациях. Далее растворы инокулируют по одной капле из пипетки на литр конечного объема, а также на бланк.

Наконец раствор доводят до объема с помощью сифона, доходящего до дна колбы. Это обеспечивает достаточное перемешивание. В дальнейшем каждый приготовленный раствор немедленно откачивают для заполнения соответствующей группы бутылей сифоном из нижней четверти (не со дна) бутылки.

Кроме того, нулевые контроли анализируются или сохраняются для последующего анализа (для определения O2 осаждением MnCl2 (хлорид марганца(II)) и NaOH (гидроксид натрия)).

Остальные параллели помещают в водяную баню при температуре 20°С, выдерживают в темноте, вынимают из бани или вольера через пять, 15 и 28 дней соответственно и анализируют.

Каждая серия сопровождается полной параллельной серией для определения бланка, обеднения кислородом без инокуляции и контрольного вещества.

Тест на ингибирование:

Вещества можно легко и просто проверить на ингибирующее действие в тесте в закрытой бутылке:

серия 1: 2 мг на литр хорошо разлагаемого соединения, например жирный спирт, конденсированный с оксидом этилена, в молекулярном соотношении 1/10 или с любым из контрольных химикатов,

серия 2: х мг на литр испытуемого материала (х обычно равно 2),

серия 3: 2 мг на литр хорошо разлагаемых соединений плюс х мг на литр испытуемого материала.

Если значения БПК серии 3 меньше суммы значений БПК серий 1 и 2, испытуемый материал можно считать ингибирующим для бактерий в этой концентрации. Этот контрольный эксперимент всегда необходим, если отрицательный или плохой результат разложения кажется нелогичным с учетом структуры испытуемого материала, т. е. если есть указания на то, что он может быть вызван ингибированием.

1.6.5. Определение растворенного кислорода

Растворенный кислород определяют химическим или электрохимическим методом международного или национального признанного стандарта.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

Результаты анализа фиксируются на прилагаемом бланке (см. приложение 3).

Ход испытания на деградацию прослеживается графически на диаграмме, как показано в прилагаемом примере (см. Приложение 4).

Результаты теста на деградацию действительны, если соблюдены следующие условия: >PIC FILE="T0027442">

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Протоколы испытаний

Протокол испытаний должен, по возможности, содержать следующее: - данные должны быть представлены по форме (см. приложение 3);

- ход испытания на деградацию представлен графически на диаграмме, показывающей фазу задержки, фазу деградации, наклон и временное окно («временное окно» здесь означает 10-дневный период, начиная со дня, когда наблюдаемый уровень биодеградации впервые превышает 10 %),

- метод, используемый для определения ХПК,

- метод, используемый для измерения содержания кислорода,

- процедура диспергирования веществ, плохо растворимых в условиях испытания,

- подтверждение валидности теста.

3.2. Интерпретация результатов

Следует учитывать возможность того, что азотсодержащие соединения могут повлиять на результаты.

Из-за строгости этого теста низкий результат не обязательно означает, что испытуемое соединение не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывает на то, что для установления этого потребуется дополнительная работа.

Испытуемые химические вещества, показавшие в этом тесте высокий результат поглощения кислорода, следует рассматривать как легко биоразлагаемые при условии, что этот уровень достигается в течение 10-дневного интервала, считая со дня, когда наблюдаемый уровень биоразложения впервые превысит 10 %.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 301D, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) Герике, П., Фишер, В.К., Корреляционное исследование определения биоразлагаемости с различными химическими веществами в различных тестах, Экотоксикология и экологическая безопасность, том. 3, № 2, 1979, стр. 159–173.

(3) Герике, П., Фишер, В.К., Корреляционное исследование определения биоразлагаемости с различными химическими веществами в различных тестах. II. Дополнительные результаты и выводы // Экотоксикология и экологическая безопасность. 5, № 1, 1981, стр. 45–55.

Приложение 1. Расчет теоретической биохимической потребности в кислороде

>ФАЙЛ ПИК="T0027443">

Приложение 2

>ФАЙЛ ПИК="T0027444">

Приложение 3

Биотическая деградация: испытание в закрытом флаконе (форма листа)

>ФАЙЛ ПИК="T0027445">

>ФАЙЛ ПИК="T0027446">

Приложение 4

>PIC-ФАЙЛ="T0027447">

>ФАЙЛ ПИК="T0027448">

C. 7. ДЕГРАДАЦИЯ БИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ: МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТЕСТ MITI

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью этого метода испытаний является измерение биоразлагаемости органических веществ в водной среде с помощью закрытого респирометра, дающего показания биохимической потребности в кислороде.

Эмпирическая формула исследуемого материала необходима для расчета теоретической потребности в кислороде (ThOD), в противном случае можно использовать COD.

Метод применим только к тем органическим испытуемым веществам, которые в используемой в испытании концентрации: - имеют незначительное давление пара;

- не подавляют бактерии,

- Не прикасайтесь к абсорбенту CO2 и не вступайте в реакцию с ним.

Если испытуемый материал не растворяется при испытуемой концентрации, для достижения хорошей дисперсии испытуемого вещества могут потребоваться специальные меры, такие как использование ультразвукового диспергирования.

Информация о токсичности химического вещества для микроорганизмов может быть полезна для интерпретации заниженных результатов и выбора подходящих тестовых концентраций.

Информация об относительных пропорциях основных компонентов испытуемого вещества будет полезна при интерпретации полученных результатов.

1.2. Определения и единицы измерения >PIC FILE="T0027449">

где:

БПК = биохимическая потребность в кислороде испытуемого соединения (экспериментального) (в миллиграммах), измеренная на кривой БПК,

B = потребление кислорода базовой культуральной средой, в которую добавляется инокулят (экспериментальное) (в миллиграммах), измеренное по кривой БПК,

ThOD = теоретическая потребность в кислороде, необходимая, когда испытуемое соединение полностью окислено (теоретическое) (в миллиграммах),

Sa = остаточное количество испытуемого соединения после завершения теста на биоразлагаемость (экспериментальное) (в миллиграммах),

Sb = остаточное количество испытуемого соединения в холостом тесте с водой, к которому было добавлено только испытуемое соединение (экспериментальное) (в миллиграммах).

1.3. Эталонные вещества

Для проверки активности инокулята желательно использование контрольных веществ. Для этой цели можно использовать анилин, ацетат натрия или бензоат натрия. Если процент разложения анилина, рассчитанный по потреблению кислорода, не превышает 40 % через семь дней и 65 % через 14 дней, тест считается недействительным. Если скорость восстановления Sb оказывается достаточно низкой, испытание также считается недействительным.

1.4. Принцип метода испытаний

Испытательные химикаты являются единственными источниками органического углерода, и микроорганизмы не подвергаются предварительной адаптации к тестируемым химикатам.

Используется автоматизированный аппарат измерения потребления кислорода закрытой системы (БПК-метр). Химические вещества, подлежащие тестированию, инокулируются микроорганизмами в испытательных сосудах. В течение периода тестирования биохимическая потребность в кислороде непрерывно измеряется с помощью измерителя БПК. Биоразлагаемость рассчитывается на основе БПК и проводится дополнительный химический анализ, например, измерение концентрации растворенного органического углерода, концентрации остаточных химикатов и т. д.

1,5. Критерии качества 1.5.1. Воспроизводимость:

В целом хорошо, особенно для химикатов с растворимостью в воде более 0,1 г на литр.

1.5.2. Чувствительность:

(A) Потребление кислорода: предел обнаружения = 1 мг (потребление кислорода микроорганизмами)

(Б) Химический анализ: зависит от чувствительности аналитических методов.

1.5.3. Специфика: >PIC FILE="T0027450">

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Дистиллированная вода не должна содержать более 10 % углерода, вносимого испытуемым веществом.

1.6.1.2. Базальная культуральная среда

К каждому 3 мл раствора А, раствора В, раствора С и раствора D добавляют воду до 1000 мл (всегда используют деионизированную воду). >ФАЙЛ ПИК="T0027451">

>ФАЙЛ ПИК="T0027452">

1.6.2. Аппарат

Измеритель БПК, оснащенный шестью флаконами (по 300 мл каждый):

бутылки 1 и 2:

деионизированная вода, 300 мл + тестовый химикат, 30 мг

бутылки 3 и 4:

базальная культуральная среда, 300 мл + активный ил, 9 мг (сухая основа) + тестируемое вещество, 30 мг

бутылка 5:

базальная культуральная среда, 300 мл + активный ил, 9 мг (сухая основа) + анилин или другое вещество сравнения, 30 мг

бутылка 6:

базальная питательная среда, 300 мл + активный ил, 9 мг (сухая основа)

1.6.3. Препараты инокулята 1.6.3.1. Активный ил

Места отбора проб осадка: Отбор проб осадка производится, в принципе, не менее чем в 10 местах по всей стране, главным образом в тех районах, где можно считать, что различные химические вещества были употреблены и выброшены.

Например, в Японии стандартный активный ил Японского центра химического биотестирования получается из следующих мест и смешивается: - Городские очистные сооружения: три завода, расположенные в северной, центральной и южной частях Японии,

- Установка промышленной канализации: одна установка используется для очистки сточных вод химической промышленности,

- Река: три реки, расположенные в северной, центральной и южной частях Японии.

- Озеро: одно озеро, расположенное в центре Японии,

- Море: два внутренних моря Японии.

Частота отбора проб осадка: Отбор проб осадка должен производиться, как правило, четыре раза в год (март, июнь, сентябрь и декабрь).

Методы отбора проб осадка: - Городские сточные воды: один литр переработанного осадка на очистных сооружениях,

- Реки, озера и болота или море: один литр поверхностной воды и один литр поверхностной почвы на пляже, которая контактирует с атмосферой,

Подготовка:

Пробы ила, собранные с мест отбора проб, перемешивают в одном контейнере и оставляют смесь отстояться. Плавающие посторонние вещества удаляют, а надосадочную жидкость фильтруют с помощью фильтровальной бумаги № 2. Фильтрат доводят до pH 7,0±1,0 с помощью гидроксида натрия или фосфорной кислоты, переносят в культуральный резервуар и аэрируют.

Культура:

После прекращения аэрации полученного выше раствора примерно на 30 минут удаляют примерно одну треть всего объема надосадочной жидкости. К оставшейся части надосадочной жидкости добавляют равный объем 0,1 % синтетических сточных вод и снова аэрируют смесь (0,1 % синтетические сточные воды: растворяют 1 г глюкозы, 1 г пептона и 1 г монокалийфосфата). в 1 л воды и доводят pH раствора до 7,0±1,0 гидроксидом натрия). Эту процедуру повторяют один раз в день. Культивирование проводят при температуре 25±2°С.

Контроль:

Для контроля этапа культивирования проверяются следующие параметры и вносятся необходимые корректировки: - Внешний вид надосадочной жидкости: надосадочная жидкость активного ила должна быть прозрачной.

- Осадительные свойства активного ила: активный ил в виде крупных хлопьев должен иметь хорошие осаждающие свойства.

- Состояние образования активного ила: в случае, когда роста хлопьев не наблюдается, необходимо добавить либо объем 0,1 % синтетических сточных вод, либо увеличить частоту добавления синтетических сточных вод.

- pH надосадочной жидкости составляет 7,0±1,0.

- Температура: температура выращивания активного ила составляет 25 ± 2 °C.

- Объем аэрации: при замене надосадочной жидкости синтетическими сточными водами суспензия в культуральном резервуаре должна быть достаточно аэрирована, чтобы поддерживать концентрацию растворенного кислорода в растворе выше 5 мг на литр.

- Микрофлора активного ила: при микроскопическом исследовании активного ила (при увеличении от 100 до 400 раз) необходимо увидеть множество простейших разных видов вместе с мутными хлопьями.

- Смешивание свежего и старого активного ила: чтобы поддерживать одинаковую активность свежего и старого активного ила, фильтрат надосадочной жидкости активного ила, используемого в тесте, смешивают с равным объемом фильтрата надосадочной жидкости свежесобранный активный ил и смесь культивируют.

- Проверка активности активного ила: активность активного ила следует проверять периодически, не реже одного раза в три месяца, с использованием стандартных веществ, используя метод испытаний, представленный ниже. Особенно в том случае, когда смешиваются образцы свежего и старого активного ила, необходимо провести тщательную проверку в отношении старого активного ила.

Пример подготовки проб активного ила и срок использования: >PIC FILE="T0027453">

(Следует та же схема приготовления и использования.)

1.6.4. Предварительная обработка тестируемого химиката

Если испытуемое соединение не растворяется в воде до испытуемой концентрации, его следует измельчить как можно мельче.

1.6.5. Добавление тестируемого соединения и подготовка к тесту

Необходимы следующие испытательные сосуды (см. 1.6.2), отрегулированные на температуру испытания: (1) два испытательных сосуда, содержащие воду, в которую добавлено 100 мг на литр испытуемого соединения (сосуды 1 и 2);

(2) Два тестовых сосуда, содержащих базальную культуральную среду, в которую добавляют 100 мг на литр тестируемого соединения: pH этого раствора доводят до 7 перед инокуляцией активного ила, если это необходимо (сосуды 3 и 4);

(3) Испытательный сосуд, содержащий базальную культуральную среду, в которую добавлено 100 мг на литр анилина или любого другого эталонного вещества (сосуд 5);

(4) Испытательный сосуд для контрольного холостого теста, содержащий только базальную культуральную среду (сосуд 6).

1.6.5.1. Инокуляция активным илом

Инокулят добавляется в испытательные сосуды 3, 4, 5 и 6 выше так, чтобы взвешенное вещество, определенное в японских промышленных стандартах (3), например, содержалось в концентрации 30 мг на литр.

1.6.5.2. Условия испытаний

Концентрация тестируемых химикатов: 100 мг на литр.

Концентрация активного ила: 30 мг на литр.

Температура испытания: от 20 до 25 °C,

Срок: 28 дней.

Выступайте в темноте. Ежедневно следует проверять температуру, изменение цвета содержимого культурального сосуда. Энергично перемешайте механической мешалкой.

1.6.6. Производительность теста

Кривая БПК регистрируется в виде непрерывной линии в течение 28 дней (см. рисунок).

После 28-дневного периода тестирования определяют pH и концентрацию остаточных химикатов и промежуточных продуктов в испытательных сосудах. >ФАЙЛ ПИК="T0027454">

Тестовые химикаты в испытательном сосуде без активного ила также анализируются, чтобы подтвердить, есть ли какие-либо изменения в тестируемом химикате в течение периода тестирования или какая-либо потеря исходного тестируемого химиката в результате испарения или адсорбции стенками испытательных сосудов. и т. д.

1.6.7. Аналитическое оборудование

Если испытуемое соединение растворимо в воде, в конце испытания также определяют остаточное количество общего органического углерода. (a) При использовании анализатора общего органического углерода:

Из испытательного сосуда отбирают 10 мл испытуемого раствора и центрифугируют при 3000 g в течение пяти минут. Остаточное количество общего органического углерода в надосадочной жидкости определяют на анализаторе общего органического углерода.

(b) При использовании других анализаторов:

Все содержимое испытательного сосуда экстрагируют подходящим растворителем для испытуемого соединения и после надлежащей предварительной обработки, такой как концентрирование, определяют остаточное количество испытуемого соединения на анализирующем приборе (газовый хроматограф, масс-спектрометр, спектрофотометр и т. д.). .).

Для летучих химикатов ванну контроля температуры измерителя БПК следует охладить до 10 °C и поддерживать эту температуру не менее 30 минут, чтобы предотвратить испарение. Затем следует приступить к аналитическим процедурам (а) и (б).

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА 2.1. Обработка результатов

Метод расчета процентной деградации по потреблению кислорода и по результатам прямого анализа определен в 1.2.

2.2. Оценка результатов

Теоретическая потребность в кислороде может быть рассчитана либо как показано в Приложении 2, либо с использованием оригинальной процедуры MITI: >PIC FILE= "T0027455">

3. ОТЧЕТНОСТЬ 3.1. Отчет об испытаниях

Протокол испытаний должен, по возможности, включать следующие пункты: - информацию об испытуемом химикате (название, структурная формула, молекулярная масса, чистота, природа примесей, физико-химические свойства испытуемого химиката, идентификационные данные испытуемого химиката),

- условия испытаний,

- Активный ил: места отбора проб ила и концентрация,

- тестовое химическое вещество: концентрация,

- испытательный срок,

- температура испытания,

- аналитическая процедура:

предварительная обработка,

аналитические условия прибора,

скорость восстановления анализа,

идентификация промежуточного,

- Результаты:

кривые биодеградации (проверка активности инокулята + кривая вещества) >PIC FILE="T0027456">

Процент разложения по БПК

процент разложения по химическому анализу,

хроматограммы или спектры тестовых химикатов, полученные и используемые для анализа,

подтверждение действительности (см. пункт 1.3).

3.2. Интерпретация результатов

Следует учитывать возможность того, что азотсодержащие соединения могут повлиять на результаты.

Если окажется, что степень извлечения Sbb составляет порядка 10% или менее, это будет указывать на аналитические проблемы или, например, на гидролиз; в таком случае следует уделить особое внимание интерпретации.

Из-за строгости этого теста низкий результат не обязательно означает, что испытуемое соединение не является биоразлагаемым в условиях окружающей среды, но указывает на то, что для установления этого потребуется дополнительная работа.

Испытуемые химические вещества, показавшие высокий результат поглощения кислорода в этом тесте, следует рассматривать как легко биоразлагаемые при условии, что этот уровень достигается в течение 10 дней, считая со дня, когда наблюдаемый уровень биоразложения впервые превышает 10 %.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 301 C, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) Испытание химических веществ на биоразлагаемость и биоаккумуляцию (C-5/98/JAP), 1978 год.

(3) Закон о контроле над химическими веществами в Японии (Отдел безопасности химической продукции, Бюро основных отраслей промышленности, MITI) (C-2/78/JAP), 1978 г.

(4) Биоразлагаемость и биоаккумуляция новых и существующих химических веществ, 5,8 (C-3/78/JAP), 1978.

Приложение 1. Принцип работы прибора для измерения потребления кислорода закрытой системы.

Потребление кислорода микроорганизмами можно определить с помощью процесса электрохимического анализа (например, кулонометрии). >PIC-ФАЙЛ="T0027457">

Образец, содержащийся в бутылке для культивирования (1), перемешивают с помощью магнитной мешалки (2). По мере развития реакции растворенный в жидкости кислород будет расходоваться. Кислород (O2) в пространстве бутыли для культивирования растворяется в жидкости, в результате чего на его месте образуется CO2.

Поскольку этот CO2 поглощается натронной известью (3), парциальное давление кислорода в пространстве и общее давление уменьшаются.

Падение давления фиксируется и преобразуется в электрический сигнал с помощью манометра электродного типа (4) и усиливается усилителем (5) для срабатывания релейной цепи (6), что приводит к срабатыванию синхронного двигателя (8). . Одновременно постоянным током генерируется электролитический кислород из сернокислого раствора меди, содержащегося в электролитере (7).

Этот кислород подается в бутыль для выращивания и с помощью манометра фиксируется восстановление давления, что приводит к отключению цепи реле и остановке электролитического и синхронного двигателя.

Верхнее пространство бутыли для культивирования всегда находится под постоянным давлением кислорода, и количество кислорода, потребляемого в бутылке для культивирования, пропорционально количеству электролитического кислорода. Поскольку это количество электролитического кислорода пропорционально времени электролиза, существует постоянный ток электролиза. Соответственно, угол вращения синхронного двигателя (9) преобразуется в сигнал мВ с помощью потенциометра блокировки, в результате чего на регистраторе (10) появляется индикатор количества израсходованного кислорода.

Приложение 2. Расчет теоретической биохимической потребности в кислороде

>ФАЙЛ ПИК="T0027458">

Приложение 3 Биотическая деградация: модифицированный тест MITI

>ФАЙЛ ПИК="T0027459">

Приложение 4

>ФАЙЛ ПИК="T0027460">

>ФАЙЛ ПИК="T0027461">

C. 8. РАЗРУШЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПОТРЕБНОСТИ В КИСЛОРОДЕ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение биохимической потребности в кислороде (БПК) твердых или жидких органических веществ.

Данные, полученные с помощью этого теста, относятся к водорастворимым соединениям; однако летучие соединения и соединения с низкой растворимостью в воде также могут, по крайней мере в принципе, быть протестированы.

Метод применим только к тем органическим испытуемым материалам, которые не подавляют рост бактерий в концентрации, используемой в тесте. Если испытуемый материал не растворяется при испытуемой концентрации, для достижения хорошего диспергирования испытуемого материала могут потребоваться специальные меры, такие как использование ультразвукового диспергирования.

Информация о токсичности химического вещества может быть полезна для интерпретации заниженных результатов и выбора подходящих тестовых концентраций.

1.2. Определение и единицы измерения

БПК определяется как масса растворенного кислорода, необходимая для определенного объема раствора вещества для процесса биохимического окисления в заданных условиях.

Результаты выражаются в граммах БПК на грамм тестируемого вещества.

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества для калибровки пока не могут быть рекомендованы. Для проверки активности инокулята желательно использовать подходящий контрольный химикат.

1.4. Принцип метода испытаний

Заранее определенное количество вещества, растворенного или диспергированного в подходящей хорошо аэрируемой среде, инокулируют микроорганизмами и инкубируют при постоянной определенной температуре окружающей среды в темноте.

БПК определяют по разнице содержания растворенного кислорода в начале и в конце теста. Продолжительность испытания должна составлять не менее пяти дней и не более 28 дней.

Холостой тест должен быть определен в параллельном анализе, не содержащем тестируемого вещества.

1,5. Критерии качества

Определение БПК не может рассматриваться как достоверное определение биоразлагаемости вещества. Этот тест можно рассматривать только как скрининговый тест.

1.6. Описание метода испытаний

Предварительный раствор или дисперсию вещества готовят для получения концентрации БПК, совместимой с используемым методом. Затем БПК определяют с помощью любого подходящего национального стандартизированного метода. Предпочтительным было бы международное соглашение, которое еще предстоит согласовать.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

БПК, содержащийся в предварительном растворе, рассчитывается по выбранному нормализованному методу и пересчитывается в граммы БПК на грамм испытуемого вещества.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Должен быть указан использованный метод.

Биохимическая потребность в кислороде должна быть средним значением как минимум трех достоверных измерений.

Должна быть указана вся информация и замечания, имеющие отношение к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей, физического состояния, токсических эффектов и собственного состава вещества, которое может повлиять на результаты.

Необходимо сообщить об использовании добавки для ингибирования биологической нитрификации.

4. ССЫЛКИ

Список стандартизированных методов, например: >PIC FILE="T0027462">

Определение биохимической потребности в кислороде, Методы исследования воды и связанных с ней материалов, HMSO, Лондон.

C. 9. РАЗРУШЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПОТРЕБНОСТИ В КИСЛОРОДЕ

1. МЕТОД 1.1. Введение

Целью метода является измерение химической потребности в кислороде (ХПК) твердых или жидких органических веществ стандартным произвольным способом в фиксированных лабораторных условиях.

Информация о формуле вещества будет полезна для проведения данного теста и интерпретации полученного результата (например, соли галогенов, соли железа органических соединений, хлорорганические соединения).

1.2. Определения и единицы измерения

Химическая потребность в кислороде — это мера окисляемости вещества, выраженная как эквивалентное количество кислорода в окислительном реагенте, потребляемом веществом в определенных лабораторных условиях.

Результат выражается в граммах ХПК на грамм испытуемого вещества.

1.3. Эталонные вещества

Эталонные вещества не обязательно использовать во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны служить в первую очередь для периодической калибровки метода и обеспечения возможности сравнения результатов при применении другого метода.

1.4. Принцип метода испытаний

Заданное количество вещества, растворенного или диспергированного в воде, окисляют дихроматом калия в сернокислой среде с сернокислым серебром в качестве катализатора при кипячении с обратным холодильником в течение двух часов. Остаточный дихромат определяют титрованием стандартизированным сульфатом железа и аммония.

В случае хлорсодержащих веществ добавляется сульфат ртути, чтобы уменьшить влияние хлоридов.

1,5. Критерии качества

Из-за произвольного способа определения ХПК следует рассматривать скорее как «индикатор окисляемости», чем как меру органического вещества.

Хлорид может помешать этому тесту; неорганический восстановитель или окислитель также может мешать определению ХПК.

Некоторые циклические соединения не полностью окисляются в этом тесте.

1.6. Описание метода испытаний

Предварительный раствор или дисперсию вещества готовят для получения ХПК от 250 до 600 мг на литр.

Примечания:

В случае плохо растворимых и недиспергируемых веществ можно отвесить количество тонкоизмельченного вещества или жидкого вещества, соответствующее примерно 5 мг ХПК, и поместить в экспериментальный аппарат с водой.

Затем ХПК определяется с использованием любого подходящего национального стандартизированного метода до публикации метода, стандартизированного на международном уровне, который будет предпочтительным.

2. ДАННЫЕ И ОЦЕНКА

ХПК, содержащаяся в экспериментальной колбе, рассчитывается в соответствии с выбранным нормализованным методом и конвертируется в граммы ХПК на грамм тестируемого вещества.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

Должен быть указан использованный эталонный метод.

Химическая потребность в кислороде должна представлять собой среднее значение по крайней мере трех измерений. Должна быть указана вся информация и замечания, относящиеся к интерпретации результатов, особенно в отношении примесей, физического состояния и свойств вещества (если они известны), которые могут повлиять на результаты.

Необходимо сообщить об использовании сульфата ртути для минимизации влияния хлоридов.

4. ССЫЛКИ

Список стандартизированных методов, например: >PIC FILE="T0027463">

C. 10. ДЕГРАДАЦИЯ АБИОТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ: ГИДРОЛИЗ КАК ФУНКЦИЯ PH

1. МЕТОД

Этот метод основан на Руководстве для испытаний ОЭСР (1). 1.1. Введение

Гидролиз является важной реакцией, контролирующей абиотическую деградацию. Эта реакция особенно актуальна для веществ с низкой биоразлагаемостью; и это может влиять на стойкость вещества в окружающей среде.

Большинство реакций гидролиза имеют псевдопервый порядок, поэтому время полураспада не зависит от концентрации. Обычно это позволяет экстраполировать результаты, полученные при лабораторных концентрациях, на условия окружающей среды.

Кроме того, сообщалось о нескольких примерах (2), показывающих удовлетворительное согласие между результатами, полученными в чистой и природной воде для нескольких типов химических веществ.

Для проведения этого испытания полезно иметь предварительную информацию о давлении паров вещества.

Этот метод применим только к водорастворимым веществам. Примеси обычно влияют на результаты.

Гидролитическое поведение химических веществ следует исследовать при значениях pH, наиболее часто встречающихся в окружающей среде (pH от 4 до 9).

1.2. Определения и единицы измерения

Гидролиз относится к реакции химического вещества RX с водой. Эту реакцию можно представить как чистый обмен группы X на OH: >PIC FILE="T0027464">

где:

т = время,

C0 = концентрация вещества в момент времени 0,

Ct = концентрация вещества в момент времени t, и

2,303 = коэффициент преобразования натуральных логарифмов в десятичные.

Концентрации выражаются в граммах на литр или молях на литр.

Размерность этой константы kobs равна (время)-1.

«Период полувыведения» t1/2 определяется как время, необходимое для снижения концентрации испытуемого вещества на 50 %, то есть: >PIC FILE="T0027465">

1.3. Эталонные вещества

Необязательно использовать эталонные вещества во всех случаях при исследовании нового вещества. Они должны служить, прежде всего, для периодической проверки эффективности метода и для обеспечения возможности сравнения результатов при применении другого метода.

Ацетилсалициловая кислота (аспирин)

В качестве веществ сравнения (1) использовали 0,0-диэтиловый эфир 0-(6-метил-2-(1-метилэтил)4-пиримидинилового эфира фосфортиоевой кислоты (димпилат, диазинон).

1.4. Принцип метода испытаний

Вещество растворяют в воде в низкой концентрации, контролируют pH и температуру.

За уменьшением концентрации вещества со временем следят с помощью любой подходящей аналитической процедуры.

Логарифм концентрации отображается в зависимости от времени, и, если график представляет собой прямую линию, константу скорости первого порядка можно получить по ее наклону (см. пункт 2).

Когда невозможно определить константу скорости непосредственно для определенной температуры, обычно можно оценить константу с помощью соотношения Аррениуса, которое дает температурную зависимость константы скорости. Из линейного графика логарифма константы скорости, определенного при соответствующей температуре, как функции обратной величины абсолютной температуры K, можно экстраполировать значение константы скорости, которое невозможно было получить напрямую.

1,5. Критерии качества

В ссылке (2) сообщается, что измерения констант скорости гидролиза 13 классов органических структур могут иметь высокую точность.

Повторяемость зависит, в частности, от контроля значения pH, концентрации растворенного кислорода и может зависеть от присутствия микроорганизмов.

1.6. Описание метода испытаний 1.6.1. Реагенты 1.6.1.1. Буферные растворы

Тест проводится при трех значениях pH: 4,0, 7,0 и 9,0.

Для этой цели буферные растворы следует готовить с использованием химических реагентов класса «х.ч.» и дистиллированной или деионизированной стерильной воды. Некоторые примеры буферных систем представлены в Приложении.

Используемая буферная система может влиять на скорость гидролиза; если есть доказательства этого, следует использовать альтернативную буферную систему. В ссылке (2) вместо фосфатного рекомендуется использовать боратный или ацетатный буферы.

Если значение pH буферных растворов неизвестно при температуре, используемой во время испытания, его можно определить с помощью калиброванного pH-метра при выбранной температуре с точностью ±0,1 единицы pH.

1.6.1.2. Тестовые решения

Испытуемое вещество должно быть растворено в выбранном буфере, и его концентрация не должна превышать 0,01 М или половину концентрации насыщения, в зависимости от того, что меньше.

Использование смешивающихся с водой органических растворителей рекомендуется только для веществ с низкой растворимостью в воде.

Количество растворителя должно быть менее 1 % и не должно мешать гидролитическому процессу.

1.6.2. Аппарат

Следует использовать стеклянные колбы с закупоренными пробками, однако следует избегать попадания смазки на шлифованное соединение.

Если химическое вещество или буферная система летучие или если тест проводится при повышенных температурах, предпочтительными являются герметичные пробирки или пробирки с перегородками и следует избегать свободного пространства.

1.6.3. Аналитический метод

Используемый аналитический метод будет зависеть от природы вещества и должен быть достаточно точным и чувствительным, чтобы обнаружить снижение первоначальной концентрации на 10 %.

Метод должен быть специфичным, чтобы обеспечить определение испытуемого вещества при концентрациях испытуемого раствора, и может состоять из некоторой комбинации подходящих аналитических методов.

1.6.4. Условия испытаний

Испытания будут проводиться с использованием термостатируемой камеры или ванны с постоянной температурой, настроенной на ± 0,5 °C от выбранной температуры. Температура будет поддерживаться и измеряться с точностью ± 0,1 °C. Фотолитического вмешательства следует избегать соответствующими средствами.

Следует принять все необходимые меры предосторожности для исключения растворенного кислорода (например, путем барботирования азота или аргона в течение пяти минут перед приготовлением раствора).

1.6.5. Процедура испытания 1.6.5.1. Предварительный тест

Для всех веществ предварительное испытание следует проводить при температуре 50 ± 0,5 °C и трех значениях pH: 4,0, 7,0 и 9,0. Проводится достаточное количество измерений, чтобы иметь возможность оценить, составляет ли для каждого значения pH и при 50 °C время полураспада (t1/2) менее 2,4 часа или менее 10 % от гидролиз наблюдается через пять дней. (Можно подсчитать, что эти значения соответствуют соответственно времени полураспада менее одного дня или более одного года в условиях, более репрезентативных для условий окружающей среды (25 ° C)).

Если предварительный тест показывает, что 50 % или более испытуемого вещества гидролизуется за 2,4 часа при 50 °C или менее 10 % гидролизуется через пять дней при каждом из трех значений pH (4, 7 и 9), никаких дополнительных испытаний не требуется.

В остальных случаях и для отдельных значений рН, при которых это условие не выполнено, проводят испытание 1.

1.6.5.2. Тест 1

Испытание 1 проводится при одной температуре; предпочтительно при 50±0,5°С, по возможности в стерильных условиях при тех значениях рН, при которых предварительное испытание показало необходимость дальнейшего испытания.

Необходимо выбрать достаточное количество образцов (не менее четырех), чтобы охватить диапазон гидролиза от 20 до 70 %, чтобы проверить поведение псевдопервого порядка при указанных значениях pH.

Для каждого значения pH, при котором проводят испытание 1, определяют порядок реакции.

Оценка константы скорости при 25 °C:

Решение о том, как действовать экспериментально, зависит от того, можно ли на основании теста 1 сделать вывод о том, что реакция является псевдопервого порядка или нет.

Если на основании теста 1 нельзя с уверенностью сделать вывод о том, что реакция псевдопервого порядка, дальнейшие эксперименты необходимо проводить, как описано в тесте 2.

Если на основе теста 1 можно с уверенностью заключить, что реакция имеет псевдопервый порядок, дальнейшие эксперименты следует проводить при описанных в тесте 3. (В качестве альтернативы, при особых обстоятельствах, можно рассчитать константы скорости при 25°. С на основе констант при 50 °С, рассчитанных по результатам испытания 1 (см. 3.2)).

1.6.5.3. Тест 2

Это испытание проводят при каждом значении pH, для которого результаты испытания 1 показали необходимость его проведения: - либо при одной температуре ниже 40 °C,

- или при двух температурах выше 50°С, отличающихся друг от друга не менее чем на 10°С.

Для каждого значения pH и температуры, при которой проводится испытание 2, следует взять не менее шести точек данных, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы степень гидролиза находилась в диапазоне от 20 до 70 %.

Для одного значения pH и одной температуры определение проводят двукратно. Если испытание 2 проводится при двух температурах выше 50°С, дубликат предпочтительно проводить при более низкой из этих двух температур.

Для каждого значения pH и температуры, при которых проводится тест 2, по возможности будет дана графическая оценка времени полураспада (t1/2).

1.6.5.4. Тест 3

Это испытание проводят при каждом значении pH, для которого результаты испытания 1 показали необходимость его проведения: - либо при одной температуре ниже 40 °C,

- или при двух температурах выше 50°С, отличающихся друг от друга не менее чем на 10°С.

Для каждого pH и температуры, при которых проводится тест 3, выбираются три точки данных: первая в момент времени 0, вторая и третья, когда степень гидролиза превышает 30%; необходимо рассчитать константы kobs и t1/2.

2. ДАННЫЕ

Для поведения псевдопервого порядка значения kobs для каждого значения pH и каждой температуры испытаний можно получить из графиков логарифмов концентрации в зависимости от времени, используя выражение:

кобс = - наклон × 2,303

Кроме того, t1/2 можно рассчитать по уравнению [6].

Оцените k25 °C, применив уравнение Аррениуса, где это необходимо.

О поведении непсевдопервого порядка см. 3.1.

3. ОТЧЕТ 3.1. Составление отчетов

Протокол испытаний должен, по возможности, включать следующую информацию: - спецификацию вещества,

- любые результаты, полученные с эталонными веществами,

- принцип и детали используемого аналитического метода,

- для каждого теста: температура, значение pH, состав буфера и таблица всех точек измерения концентрации во времени,

- для реакции псевдопервого порядка значения kobs t1/2 и порядок его расчета,

- для реакции непсевдопервого порядка результаты отображаются в виде логарифма концентрации от времени,

- вся информация и наблюдения, необходимые для интерпретации результатов.

3.2. Интерпретация результатов

Можно рассчитать приемлемые значения константы скорости (при 25 °С) испытуемых веществ при условии, что экспериментальные значения энергии активации уже существуют для гомологов испытуемого вещества и при условии, что можно разумно предположить, что активация энергия исследуемого вещества имеет тот же порядок величины.

4. ССЫЛКИ (1) ОЭСР, Париж, 1981 г., Методика испытаний 111, Решение Совета C(81) 30 окончательный вариант.

(2) ОЭСР, Париж, 1981 г., Указание для испытаний 111, Решение Совета C(81) 30 окончательное, ссылка 2.

Приложение БУФЕРНЫЕ СМЕСИ

А. КЛАРК И ЛЮБС

Значения pH, указанные в этих таблицах, были рассчитаны на основе потенциальных измерений с использованием стандартных уравнений Серенсена (1909). Фактическое значение pH на 0,04 единицы выше табличных значений. >ФАЙЛ ПИК="T0027466">

Б. КОЛТХОФФ И ВЛИШОУЭР >PIC FILE="T0027467">

К. СЁРЕНСЕН >PIC FILE= "T0027468">