18.10.1993
В
Официальный журнал Европейских сообществ
Л 259/1
ДИРЕКТИВА СОВЕТА 93/85/ЕЕС
от 4 октября 1993 г.
по борьбе с кольцевой гнилью картофеля
СОВЕТ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,
Принимая во внимание Договор о создании Европейского экономического сообщества, и в частности его статью 43,
Принимая во внимание предложение Комиссии (1),
Принимая во внимание мнение Европейского парламента (2),
Принимая во внимание мнение Экономического и социального комитета (3),
Принимая во внимание, что производство картофеля занимает важное место в сельском хозяйстве Сообщества; тогда как урожай картофеля постоянно находится под угрозой со стороны вредных организмов;
Принимая во внимание, что посредством защиты выращивания картофеля от таких вредных организмов следует не только поддерживать производственный потенциал, но и повышать продуктивность сельского хозяйства;
Принимая во внимание, что защитные меры по предотвращению проникновения вредных организмов на территорию государства-члена имели бы лишь ограниченный эффект, если бы такие организмы не контролировались одновременно и методично на всей территории Сообщества и не предотвращались от распространения;
В то время как одним из вредных организмов картофеля является Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ссп. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., возбудитель кольцевой гнили картофеля; поскольку это заболевание возникло в некоторых частях Сообщества и все еще существуют некоторые ограниченные источники инфекции;
Принимая во внимание, что существует значительный риск для выращивания картофеля на всей территории Сообщества, если не будут приняты эффективные меры по обнаружению этого заболевания и определению его распространения, по предотвращению его возникновения и распространения, а в случае обнаружения - по предотвращению его распространения и контролю с помощью цель искоренения;
Принимая во внимание, что для обеспечения этого внутри Сообщества должны быть приняты определенные меры; тогда как государства-члены должны, кроме того, иметь возможность принимать дополнительные или более строгие меры, когда это необходимо, при условии, что нет никаких препятствий для перемещения картофеля внутри Сообщества, за исключением случаев, установленных Директивой Совета 77/93/EEC от 21 декабря 1976 г. о защитных мерах против ввоза в государства-члены организмов, вредных для растений или растительных продуктов (4); поскольку о таких мерах необходимо уведомлять другие государства-члены и Комиссию;
Принимая во внимание, что Директива Совета 80/665/EEC от 24 июня 1980 г. о борьбе с кольцевой гнилью картофеля (5) установила минимальные меры, которые должны быть приняты государствами-членами против кольцевой гнили картофеля;
Принимая во внимание, что с тех пор произошли значительные изменения в понимании болезни кольцевой гнили картофеля и обнаружении возбудителя кольцевой гнили картофеля;
Принимая во внимание, что применение режима здоровья растений Сообщества к Сообществу как к территории без внутренних границ потребовало пересмотра и пересмотра некоторых положений Директивы 80/665/EEC;
Поскольку в результате такого пересмотра положения Директивы 80/665/ЕЕС были признаны недостаточными и необходима дальнейшая детализация мер;
Принимая во внимание, что в такой ситуации Директива 80/665/EEC должна быть отменена и приняты необходимые меры;
При этом при проведении мероприятий необходимо учитывать, во-первых, что заболевание может оставаться латентным и незамеченным как в растущем урожае, так и в хранящихся клубнях и поэтому эффективно предотвращаться только путем производства и использования свободного от инфекции семенного картофеля, и, во-вторых, что для его обнаружения необходимы систематические официальные исследования; поскольку распространение возбудителя внутри растущего урожая не является наиболее важным фактором, но возбудитель может существовать всю зиму в самосевных (добровольных) растениях картофеля, и они являются основным источником инфекции, переносимой из одного сезона в другой. ; поскольку возбудитель распространяется главным образом при контаминации картофеля при контакте с инфицированным картофелем, а также при контакте с оборудованием для посадки, сбора и обработки урожая или контейнерами для транспортировки и хранения, которые были контаминированы организмом в результате предыдущего контакта с инфицированным картофелем; поскольку такие зараженные предметы могут оставаться заразными в течение некоторого времени после такого заражения; поскольку распространение возбудителя можно уменьшить или предотвратить путем дезинфекции таких объектов; поскольку любое подобное заражение семенного картофеля представляет собой серьезный риск распространения патогена;
Принимая во внимание, что для определения деталей таких общих мер, а также более строгих или дополнительных мер, принимаемых государствами-членами для предотвращения заноса возбудителя на их территорию, желательно, чтобы государства-члены тесно сотрудничали с Комиссией в течение Постоянный комитет по здоровью растений (далее именуемый «Комитет»),
ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:
Статья 1
Директива касается мер, которые должны быть приняты в государствах-членах против Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ссп. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., возбудителя кольцевой гнили картофеля (далее «организм»), чтобы:
(а)
найти его и определить его распространение;
(б)
предотвратить его возникновение и распространение; и
(с)
в случае обнаружения предотвратить его распространение и контролировать его с целью искоренения.
Статья 2
1. Государства-члены должны проводить систематические официальные исследования организма на клубнях и, при необходимости, на растениях картофеля (Solanum tuberosum L.), происходящих с их территории, для подтверждения отсутствия организма.
Для этих обследований, в случае клубней, должны быть взяты образцы как семенного, так и другого картофеля, предпочтительно из партий, находящихся на складе, и подвергнуты официальным или официально контролируемым лабораторным испытаниям с использованием метода, изложенного в Приложении I, для обнаружения и диагностики микроорганизма. . Кроме того, при необходимости может проводиться официальный или официально контролируемый визуальный осмотр путем разрезания клубней на другие образцы.
В случае растений эти обследования должны проводиться с использованием соответствующих методов, а образцы должны подвергаться соответствующим официальным испытаниям или испытаниям под официальным контролем.
Количество, происхождение, стратификация и сроки сбора образцов должны определяться ответственными официальными органами в соответствии с Директивой 77/93/ЕЕС на основе обоснованных научных и статистических принципов и биологии организма, а также с учетом конкретных обстоятельств. системы производства картофеля в соответствующих государствах-членах. Подробная информация должна ежегодно предоставляться другим государствам-членам и Комиссии с целью обеспечения сопоставимых уровней уверенности между государствами-членами для подтверждения отсутствия организма.
2. Результаты официальных опросов, предусмотренных в параграфе 1, должны сообщаться не реже одного раза в год другим государствам-членам ЕС и Комиссии. Подробности этого уведомления являются конфиденциальными. Они могут быть представлены Комитету в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС.
3. Следующие положения могут быть приняты в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16a Директивы 77/93/EEC;
—
подробности обследований, предусмотренных в пункте 1 выше, которые должны проводиться в соответствии с обоснованными научными и статистическими принципами,
—
реквизиты уведомления, предусмотренные пунктом 2 выше.
4. Следующие положения должны быть приняты в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16a Директивы 77/93/EEC:
—
соответствующий метод исследований и испытаний, предусмотренный в третьем подпункте пункта 1 выше.
Статья 3
Государства-члены должны обеспечить, чтобы о подозрении или подтвержденном присутствии организма в растениях и клубнях картофеля или клубнях, собранных, хранящихся или реализуемых на их территории, сообщалось их собственным ответственным официальным органам.
Статья 4
1. В случаях подозрения на происшествие ответственные официальные органы государства-члена, в котором были зарегистрированы эти случаи, должны обеспечить завершение официальных или официально контролируемых лабораторных исследований с использованием метода, изложенного в Приложении I, и в соответствии с указанными условиями. в пункте 1 Приложения II, в целях подтверждения или опровержения предполагаемого происшествия. В первом случае применяются требования, изложенные в пункте 2 Приложения II.
2. До подтверждения или опровержения подозрительного события в соответствии с пунктом 1, в тех случаях подозрительного события, когда:
(я)
замечены подозрительные диагностические визуальные симптомы заболевания; или,
(ii)
выявлен положительный результат иммунофлуоресцентного теста, как указано в Приложении I, или другой соответствующий положительный результат теста,
Ответственные официальные органы государств-членов обязаны:
(а)
запретить перемещение всех партий или грузов, из которых были взяты пробы, за исключением случаев, когда они находятся под их контролем и при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма;
(б)
принять меры по выяснению происхождения предполагаемого происшествия;
(с)
ввести соответствующие дополнительные меры предосторожности, исходя из уровня предполагаемого риска, чтобы предотвратить любое распространение организма. Эти меры могут включать официальный контроль за перемещением всех других клубней или растений внутри помещений или за их пределами, связанных с предполагаемым происшествием.
3. Следующее положение может быть принято в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:
—
меры, упомянутые в пункте 2(c) выше.
4. Следующее положение должно быть принято в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16a Директивы 77/93/EEC:
—
другое соответствующее испытание, предусмотренное в пункте 2 (ii) выше;
Статья 5
1. Если официальное или официально контролируемое лабораторное исследование с использованием метода, изложенного в Приложении I, подтверждает присутствие организма в образце клубней, растений или частей растений, ответственные официальные органы государства-члена, принимая во внимание обоснованные научные принципы, биология организма и конкретные системы производства, маркетинга и переработки в этом государстве-члене должны:
(а)
обозначать как загрязненные клубни или растения, партию и/или партию, а также оборудование, транспортное средство, сосуд, хранилище или их агрегаты, а также любые другие предметы, включая упаковочный материал, из которого была взята проба, и, при необходимости, место (я) производства и поля(ий), с которых были собраны клубни или растения;
(б)
определить, принимая во внимание положения пункта 1 Приложения III, степень вероятного загрязнения в результате контакта до или после сбора урожая или в результате производственной связи с указанным загрязнением;
(с)
разграничить зону на основе обозначения загрязнения согласно (а), определения степени вероятного загрязнения согласно (b) и возможного распространения организма, принимая во внимание положения пункта 2 Приложения III.
2. Государства-члены должны немедленно уведомить другие государства-члены и Комиссию, в соответствии с положениями пункта 3 Приложения III, о любом загрязнении, указанном в соответствии с параграфом 1 (a), и подробностях демаркации зон в соответствии с параграфом 1 (c). .
Подробности этого уведомления являются конфиденциальными. Они могут быть представлены Комитету в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС.
3. В результате уведомления в соответствии с параграфом 2 и элементов, упомянутых в нем, другие государства-члены, указанные в уведомлении, должны, при необходимости, обозначить загрязнение, определить степень вероятного загрязнения и разграничить зону в соответствии с параграфом 1 (а ), (б) и (в) соответственно.
Статья 6
Государства-члены должны предписать, что если клубни или растения были признаны зараженными в соответствии со Статьей 5 (1) (а), тестирование в соответствии со Статьей 4 (1) должно проводиться на картофельных запасах, которые клонально связаны с растениями, участвующими в загрязнение. Тестирование должно проводиться на таком количестве клубней или растений, которое необходимо для определения вероятного первичного источника инфекции и степени вероятного заражения, предпочтительно в порядке степени риска.
В результате испытаний дальнейшее определение загрязнения, определение степени вероятного загрязнения и демаркация зоны должны проводиться, в зависимости от обстоятельств, в соответствии со Статьями 5 (1) (a), (b) и (c) соответственно.
Статья 7
1. Государства-члены должны предписать, что клубни или растения, признанные загрязненными в соответствии со Статьей 5 (1) (а), не могут быть посажены и что под контролем их ответственных официальных органов они должны:
—
уничтожено или
—
утилизировать иным образом с соблюдением официально контролируемых мер в соответствии с положениями пункта 1 Приложения IV, при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма.
2. Государства-члены должны предписать, что клубни или растения, определенные как вероятно зараженные в соответствии со Статьей 5(1) (b), не могут быть высажены и, без ущерба для результатов тестирования, упомянутого в Статье 6 для клонально родственных запасов, должны, в соответствии с контроля их ответственных официальных органов, должным образом использоваться или удаляться, как указано в пункте 2 Приложения IV, таким образом, чтобы было установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма.
3. Государства-члены должны предписать, чтобы любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или их части, а также любые другие объекты, включая упаковочный материал, обозначенные как загрязненные в соответствии со статьей 5 (1) (а) или определенные как вероятно загрязненные в соответствии со статьей 5 (1) ) (b) должны быть либо уничтожены, либо очищены и продезинфицированы с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3 Приложения IV. После дезинфекции такие предметы больше не будут считаться зараженными.
4. Без ущерба для мер, реализуемых в соответствии с параграфами 1, 2 и 3, государства-члены должны предписать, чтобы в зоне, разграниченной в соответствии со статьей 5 (1) (c), ряд мер, как указано в пункте 4 Приложения IV, должно быть реализовано.
Статья 8
1. Государства-члены должны предписать, что семенной картофель должен соответствовать требованиям Директивы 77/93/ЕЕС и должен быть получен непосредственно из материала, полученного в рамках официально утвержденной программы, который был признан свободным от данного организма в ходе официального или официально контролируемого тестирования с использованием метод, указанный в Приложении I.
Вышеуказанные испытания проводятся:
—
в случаях, когда заражение затрагивает производство семенного картофеля, на растениях первичной клоновой селекции,
—
в остальных случаях - либо на растениях первичной клоновой селекции, либо на репрезентативных образцах базового семенного картофеля или более ранних размножений.
2. Следующие положения могут быть приняты в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:
—
подробные правила применения абзаца первого подпункта второго пункта 1 настоящей статьи,
—
правила о репрезентативных пробах, предусмотренные абзацем вторым подпункта второго пункта 1 настоящей статьи.
Статья 9
Государства-члены должны запретить хранение и обращение с данным организмом.
Статья 10
Без ущерба для положений Директивы 77/93/ЕЕС, государства-члены могут разрешить отступления от мер, упомянутых в Статьях 6, 7 и 9 настоящей Директивы, для экспериментальных или научных целей, а также для работы по селекции сортов, при условии, что такие отступления не наносить ущерба контролю над организмом и не создавать риска распространения организма.
Статья 11
Государства-члены могут принять такие дополнительные или более строгие меры, которые могут потребоваться для борьбы с этим организмом или предотвращения его распространения, в той степени, в которой они соответствуют положениям Директивы 77/93/ЕЕС.
Дополнительные меры, упомянутые в первом подпункте, могут включать предписание о том, что можно сажать только семенной картофель, который либо официально сертифицирован, либо официально проверен на соответствие требуемым санитарно-гигиеническим стандартам. Последнее может применяться, в частности, в том случае, если фермерам разрешено использовать в своем хозяйстве семенной картофель, полученный ими из собственного урожая, а также в других случаях, когда сажается семенной картофель собственного производства.
Подробности этих мер должны быть доведены до сведения других государств-членов ЕС и Комиссии.
Статья 12
Поправки к Приложениям к настоящей Директиве, вносимые в свете развития научных или технических знаний, должны быть приняты в соответствии с процедурой, установленной в Статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС.
Статья 13
1. К 15 ноября 1993 г. государства-члены должны принять и опубликовать положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.
Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Процедура такой ссылки должна быть принята государствами-членами.
Государства-члены ЕС должны применять эти положения с 16 ноября 1993 г.
2. Государства-члены должны немедленно сообщить Комиссии обо всех положениях национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой. Комиссия информирует об этом другие государства-члены.
Статья 14
Директива 80/665/EEC настоящим аннулируется с 16 ноября 1993 г.
Статья 15
Данная Директива адресована государствам-членам.
Совершено в Люксембурге 4 октября 1993 года.
Для Совета
Президент
В. КЛАС
(1) ОЖ № C 93, 2. 4. 1993, с. 12.
(2) ОЖ № C 176, 28. 6. 1993, с. 210.
(3) ОЖ № C 161, 14.6.1993, с. 18.
(4) ОЖ № L 26, 31. 1. 1977, с. 20. Директива с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 92/103/EEC (ОЖ № L 363, 11.12.1992, стр. 1).
(5) ОЖ № L 180, 14. 7. 1980, с. 30.
ПРИЛОЖЕНИЕ I
МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИИ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ссп. СЕПЕДОНИК (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. В ПАРТИЯХ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ
1. Удаление стержней пяточной части
1.1.
200 клубней промыть проточной водопроводной водой и удалить эпидермис вокруг пяточного конца каждого клубня с помощью регулярно дезинфицируемого скальпеля или картофелечистки; Дезинфекцию можно провести, погрузив нож в 70% этанол и поджег.
1.2.
Аккуратно ножом или картофелечисткой удалите сердцевины ткани конической формы с пяточных концов. Сведите к минимуму избыток несосудистой ткани. После удаления пяточные кончики следует обработать в течение 24 часов (см. параграф 3) или хранить при температуре -20°C не более двух недель.
2. Визуальный осмотр на наличие симптомов кольцевой гнили.
После удаления пяточных концов разрежьте каждый клубень поперек и проверьте наличие признаков кольцевой гнили.
Сожмите клубни и обратите внимание на выраженность мацерированных тканей из сосудистой ткани.
Самыми ранними симптомами являются легкая стекловидность или прозрачность тканей вокруг сосудистой системы, особенно вблизи пяточного конца, без размягчения. Сосудистое кольцо на пяточном конце может быть немного темнее, чем обычно. Первым легко распознаваемым симптомом является то, что сосудистое кольцо приобретает желтоватый цвет, а при осторожном сдавливании клубня из сосудов выходят столбики сыроподобного вещества. Этот экссудат содержит миллионы бактерий. На этом этапе может развиться побурение сосудистой ткани. Сначала эти симптомы могут ограничиваться одной частью кольца, не обязательно вблизи пяточного конца, и могут постепенно распространяться на все кольцо. По мере прогрессирования инфекции происходит разрушение сосудистой ткани; внешняя кора может отделиться от внутренней коры. На поздних стадиях заражения на поверхности клубня появляются трещины, края которых часто красновато-коричневые. Вторичная грибковая или бактериальная инвазия может маскировать симптомы, и отличить запущенные симптомы кольцевой гнили от других клубневых гнилей может оказаться затруднительным, если не невозможным.
3. Подготовка образцов для окраски по Граму, иммунофлуоресцентного окрашивания (IF) и теста на баклажанах.
3.1.
Гомогенизируйте пяточные концы до тех пор, пока не будет достигнута полная мацерация, в разбавителе, который, как известно, нетоксичен для Corynebacterium sepedonicum (например, 0,05 М фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) pH 7,0) при температуре менее 30°C; Целесообразно добавление нетоксичного дефлокулянта и может потребоваться нетоксичный пеногаситель (приложения 1 и 2). Следует избегать чрезмерной мацерации.
3.2.
Извлекают бактерии из гомогената одним из следующих методов (1):
А.
(а)
Центрифугируйте при давлении не более 180 g в течение 10 минут.
(б)
Центрифугируйте надосадочную жидкость при ускорении не менее 4000 g в течение 10 минут. Декантируйте и выбросьте супернатант.
Б.
(а)
Дайте мацерату постоять 30 минут, чтобы остатки тканей осели. Декантировать надосадочную жидкость, не нарушая осадка.
(б)
Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтровальную бумагу (Whatman No 1), помещенную в фильтр из спеченного стекла (No 2 = 40-100 мкм), используя водяной вакуумный насос. Соберите фильтрат в центрифужную пробирку. Промойте фильтр стерильным PBS до максимального объема фильтрата 35 мл.
(с)
Фильтрат центрифугировать при давлении не менее 4000 g в течение 20 минут.
3.3.
Суспендируют осадок в стерильном 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2 (Приложение 2), до получения общего объема примерно 1 мл. Разделите на две равные части и сохраните одну часть для справочных целей путем замораживания при температуре - 20 °C (2) или лиофилизации. Разделите другую часть пополам, используя одну половину для теста IF и окраски по Граму, а другую для теста с баклажанами.
3.4.
Крайне важно, чтобы все положительные контроли и образцы C. sepedonicum обрабатывались отдельно во избежание контаминации. Это относится к предметным стеклам IF и к тестам на баклажаны.
4. Окрашивание по Граму
4.1.
Подготовьте окраску по Граму для всех разведений гранул (5.2.1) и для всех разрезанных клубней (2), на которых наблюдается стекловидность, гниение или другие подозрительные симптомы. Пробы следует брать с края больных тканей.
4.2.
Подготовьте окраску по Граму для известных культур C. sepedonicum и, если возможно, для естественно инфицированной ткани (5.1).
4.3.
Определите, какие образцы содержат типичные грамположительные коринеформные клетки. Обычно клетки C. sepedonicum имеют длину от 0,8 до 1,2 мкм и ширину от 0,4 до 0,60 мкм.
Соответствующая процедура окрашивания приведена в Приложении 3.
В препаратах от естественных инфекций или недавно выделенных культур часто обнаруживают преобладание кокковидных палочек, которые обычно немного меньше клеток из других агаровых культур. В большинстве культуральных сред клетки C. sepedonicum представляют собой плеоморфные коринеформные палочки и могут давать вариабельную реакцию по Граму. Клетки одиночные, парные с характерными «локтями», типичными для изгибающего деления, а иногда и неправильными группами, часто называемыми палисадами и китайскими буквами.
5. Схема проведения ПЧ-тестирования
5.1. Используйте антисыворотку к известному штамму C. sepedonicum — ATCC 33113 (NCPPB 2137) или NCPPB 2140. Она должна иметь титр IF более 1:600. Включите один контрольный PBS на предметное стекло, чтобы определить, сочетается ли конъюгат изотиоцианата флюоресцеина с кроличьим иммуноглобулином (FITC) неспецифически с бактериальными клетками. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) следует использовать в качестве контроля гомологичного антигена на отдельном предметном стекле. Естественно инфицированную ткань (сохраненную путем лиофилизации или замораживания при температуре - 20°C) следует использовать, где это возможно, в качестве аналогичного контроля на том же предметном стекле (рис. 2).
5.2. Процедура
5.2.1.
Подготовьте три серийных десятикратных разведения (101, 102, 103) конечного осадка в дистиллированной воде (рис. 1).
5.2.2.
Отнесите пипеткой измеренный стандартный объем, достаточный для покрытия окна (приблизительно 25 мкл) каждого разведения осадка или суспензии C. sepedonicum (приблизительно 106 клеток/мл) в окна многоточечного предметного стекла, как показано на рисунке 1.
Рисунок 1
Контрольный слайд образца и PBS
фигура 2
Слайд положительного контроля
5.2.4.
Закройте соответствующие окна, в которых находится антисыворотка C. sepedonicum в рекомендуемых разведениях, 0,01 М PBS, pH 7,2 (Приложение 2), как показано на рисунке 1. (Для контроля FITC используйте PBS.) Рабочее разведение антисыворотки должно быть примерно вдвое меньше титра IF. Если необходимо включить другие разведения антисыворотки, следует подготовить отдельные слайды для каждого используемого разведения.
5.2.5.
Инкубируйте во влажной камере при температуре окружающей среды в течение 30 минут.
5.2.6.
Тщательно промыть 0,01 М PBS, pH 7,2. Промывают в течение пяти минут в три смены 0,01 М PBS, pH 7,2.
5.2.7.
Тщательно удалите лишнюю влагу.
5.2.8.
Накройте каждое окно конъюгатом FITC в том же разведении, которое использовалось для определения титра, и инкубируйте в темной влажной камере при температуре окружающей среды в течение 30 минут.
5.2.9.
Прополощите и постирайте, как раньше.
5.2.10.
Нанесите примерно от 5 до 10 мкл 0,1 М глицерина, забуференного фосфатом, pH 7,6 (или аналогичного раствора с pH не менее 7,6) на каждое окно и накройте покровным стеклом (Приложение 2).
5.2.11.
Изучите под микроскопом, оснащенным эпифлуоресцентным источником света и фильтрами, подходящими для работы с FITC. Подходящее увеличение от 400 до 1000. Сканируйте реплицированные окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру окна.
Наблюдайте за флуоресцирующими клетками в положительном контроле и определите титр. Наблюдайте за флуоресцирующими клетками в окне управления FITC/PBS и, если они отсутствуют, перейдите к окнам тестирования. Определите в минимум 10 полях микроскопа среднее количество морфологически типичных флуоресцирующих клеток в поле зрения и рассчитайте их количество на мл неразведенного осадка (Приложение 4).
Есть несколько проблем, присущих иммунофлуоресцентному тесту.
—
Фоновые популяции флуоресцирующих клеток с атипичной морфологией и перекрестно реагирующими сапрофитными бактериями, размерами и морфологией сходными с Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, вероятно, встречаются в картофельных гранулах. Рассмотрим только флуоресцирующие клетки типичного размера и морфологии.
Из-за возможности перекрестных реакций образцы с положительным результатом иммунофлуоресцентного теста следует тестировать с использованием другой антисыворотки.
—
Технический предел обнаружения этого метода находится между 103 и 104 клеток на мл неразбавленного осадка. Образцы с количеством типичных клеток IF на пределе обнаружения обычно отрицательны в отношении C. m. ссп. sepedonicus, но может быть направлен на тестирование баклажанов.
Отрицательный результат иммунофлуоресценции выявляется для любого образца, в котором не обнаружены морфологически типичные флуоресцентные клетки. Пробы следует считать «не контаминированными» Clavibacter michiganensis ssp. сепедоник.
Тест на баклажаны не требуется.
Положительная реакция иммунофлуоресценции выявляется для любого образца, в котором обнаружены морфологически типичные флуоресцирующие клетки.
Образцы, для которых был выявлен положительный результат иммунофлуоресцентного теста с обеими антисыворотками, считаются «потенциально контаминированными» Clavibacter michiganensis ssp. сепедоник.
Тест на баклажаны требуется для всех образцов, считающихся потенциально загрязненными.
6. Тест с баклажанами
Подробности о культуре см. в Приложении 5.
6.1. Распределите гранулу из 3.3 между как минимум 25 баклажанами на стадии 3 листьев (Приложение 5) одним из методов, приведенных ниже (6.2, 6.3 или 6.4).
6.2. Щелевая прививка I
6.2.1.
Поддерживайте каждый горшок горизонтально (блок пенополистирола с куском глубиной 5 см, шириной 10 см и длиной 15 см, снятый с одной поверхности (рис. 3), достаточен для горшка диаметром 10 см). Полоску стерильной алюминиевой фольги следует поместить между ножкой и блоком для каждого тестируемого образца. Растение можно удерживать на месте с помощью резиновой ленты вокруг блока.
6.2.2.
Скальпелем сделайте продольный или слегка диагональный надрез длиной от 0,5 до 1,0 см и глубиной примерно на три четверти диаметра стебля между семядолями и первым листом.
6.2.3.
Держите разрез открытым кончиком лезвия скальпеля и нанесите в него инокулят, используя подводку для глаз или тонкую художественную кисть, наполненную гранулами. Оставшуюся часть лепешки распределите между баклажанами.
6.2.4.
Запечатайте разрез стерильным вазелином из цилиндра шприца объемом 2 мл.
Рисунок 3
6.3. Щелевая инокуляция II
6.3.1.
Держа растение двумя пальцами, нанесите пипеткой каплю (примерно 5–10 мкл) взвешенного осадка на стебле между семядолями и первым листом.
6.3.2.
Стерильным скальпелем сделайте диагональный (под углом примерно 5°) надрез длиной 1,0 см и глубиной примерно 2/3 толщины стебля, начиная срез от капли гранулы.
6.3.3.
Запечатайте порез стерильным вазелином из цилиндра шприца.
6.4. Прививка шприцем
6.4.1.
Не поливайте баклажаны за сутки до инокуляции, чтобы снизить тургорное давление.
6.4.2.
Инокулируют стебли баклажанов чуть выше семядолей с помощью шприца с иглой для подкожных инъекций (не менее 23G). Распределите лепешку между баклажанами.
6.5. Инокулируют 25 растений известной культурой C. sepedonicum и, если возможно, естественно инфицированной тканью клубня (5.1) одним и тем же методом инокуляции (6.2, 6.3 или 6.4).
6.6. Инокулируют 25 растений стерильным 0,05 М PBS тем же методом инокуляции (6.2, 6.3 или 6.4).
6.7. Инкубируйте растения в соответствующих условиях (приложение 5) в течение 40 дней. Регулярно проверяйте наличие симптомов через восемь дней. Подсчитайте количество растений, у которых проявляются симптомы. C. sepedonicum вызывает увядание листьев баклажанов, которое может начинаться с вялости краев или межжилковых жилок. Увядшая ткань может сначала выглядеть темно-зеленой или пятнистой, но затем становится бледнее, прежде чем стать некротической. Межжилковые увядания часто имеют жирный, пропитанный водой вид. Некротическая ткань часто имеет ярко-желтый край. Растения не обязательно погибают; чем дольше период до развития симптомов, тем больше шансов на выживание. Растения могут перерасти инфекцию. Восприимчивые молодые баклажаны гораздо более чувствительны к низким популяциям C. sepedonicum, чем более старые растения, поэтому необходимо использовать растения на стадии 3 листьев или непосредственно перед ней.
Увядание также может быть вызвано популяциями других бактерий или грибов, присутствующими в осадке ткани клубня. К ним относятся Erwinia carotovora, subsp. carotovora и E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, а также большие популяции сапрофитных бактерий. Такое увядание можно отличить от увядания, вызванного C. sepedonicum, поскольку быстро увядают целые листья или целые растения.
6.8. Подготовьте окраску по Граму (4) для всех партий баклажанов с симптомами, используя срезы увядших тканей листьев и стеблей растений, и изолируйте их на подходящей питательной среде (7). Поверхность листьев и хвостов баклажанов дезинфицируют протиранием 70 % этанолом.
6.9. При определенных обстоятельствах, в частности, когда условия выращивания не являются оптимальными, C. sepedonicum может существовать в виде латентной инфекции в баклажанах даже после инкубации в течение 40 дней. Такие инфекции могут привести к задержке роста и отсутствию жизнеспособности инокулированных растений. Если тест IF считается положительным, может быть сочтено необходимым провести дальнейшее тестирование. Поэтому очень важно сравнивать скорость роста всех тестовых растений баклажанов со стерильными контролями, инокулированными 0,05 М PBS, и контролировать условия окружающей среды в теплице.
Рекомендации по дальнейшему тестированию следующие:
6.9.1.
вырезаем стебли над местом прививки и удаляем листья;
6.9.2.
стебли мацерируют в 0,05 М PBS, pH 7,0, как в 3,1-3,2;
6.9.3.
используйте половину гранулы для окраски по Граму (4) и теста IF (5);
6.9.4.
используйте вторую половину для проведения следующего теста на баклажан (6), если окрашивание по Граму и/или тест IF положительны. Используйте известную культуру C. sepedonicum и стерильные контроли 0,05 М PBS. Если при последующем тесте симптомы не наблюдаются, пробу следует считать отрицательной.
7. Изоляция С. сепедоникум
Диагноз может быть подтвержден только в том случае, если C. sepedonicum выделен и таким образом идентифицирован (8). Хотя C. sepedonicum — требовательный микроорганизм, его можно выделить из тканей с симптомами. Однако он может перерасти быстрорастущими сапрофитными бактериями, поэтому выделение непосредственно из осадка ткани клубня (3.3) не рекомендуется. Баклажаны представляют собой превосходную селективную обогащенную среду для роста C. sepedonicum, а также являются отличным подтверждающим тестом на хозяина.
Изоляты следует делать из всех клубней картофеля и баклажанов с симптомами (4, 6). Мацерацию стеблей баклажанов при необходимости следует проводить, как в 3. и 6.9.
7.1.
Нанесите штрихами суспензию на одну из следующих сред: (формулы приведены в приложении 6):
питательный декстрозный агар (только для пересевов),
дрожжевой пептонно-глюкозный агар,
питательный дрожжевой декстрозный агар,
агар с дрожжевым экстрактом и минеральными солями.
Инкубируйте при температуре 21 oC до 20 дней.
C. sepedonicum растет медленно и обычно в течение 10 дней образует точечные кремовые куполообразные колонии.
Повторная полоса для установления чистоты.
Темпы роста улучшаются с помощью субкультуры. Типичные колонии кремово-белые или цвета слоновой кости, округлые, гладкие, приподнятые, выпукло-купольные, слизисто-жидкие, с цельными краями, обычно диаметром от 1 до 3 мм.
Идентификация
Многие грамположительные коринеформные бактерии с колониальными признаками, сходными с таковыми у C. sepedonicum, могут быть выделены из здорового или больного картофеля и баклажанов. В этом контексте C. sepedonicum необходимо идентифицировать с помощью следующих тестов:
ЕСЛИ тест (5.1),
тест на баклажаны,
питание и физиологические тесты (Приложение 7),
—
тест на окисление/ферментацию (O/F),
—
оксидазный тест,
—
рост при 37oC,
—
производство уреазы,
—
гидролиз эскулина,
—
гидролиз крахмала,
—
переносимость 7 % раствора натрия хлорида,
—
индоловый тест,
—
каталазный тест,
—
производство H28,
—
использование цитрата,
—
гидролиз желатина
—
кислоты из: глицерина, лактозы, рамнозы и салицина,
—
Окраска по Граму.
Все тесты должны включать известный контроль C. sepedonicum. Пищевые и физиологические тесты следует проводить с использованием инокулята из субкультур питательного агара. Морфологические сравнения следует проводить с культурами питательного декстрозного агара.
Для теста IF популяция клеток должна быть доведена до 106 клеток/мл. Титр IF должен быть аналогичен титру известной культуры C. sepedonicum.
Для теста на баклажанах популяцию клеток следует довести до примерно 107 клеток/мл. Тесты на баклажанах следует проводить с использованием 10 растений для каждого из тест-организмов, снова используя известную культуру C. sepedonicum и контрольную стерильную воду; в случае чистых культур типичное увядание должно наблюдаться в течение 20 дней, а растения, не проявляющие симптомов по истечении этого времени, следует инкубировать в общей сложности 30 дней при температуре, способствующей росту баклажанов, но не превышающей 30°С (Приложение 5). Если через 30 дней симптомы отсутствуют, культура не может быть подтверждена как патогенная форма Corynebacterium sepedonicum.
Тест
С. сепедоникус
ИЗ
Инертный или слабоокислительный
Оксидаза
-
Каталаза
+
Снижение нитратов
-
Уреазная активность
-
Производство H2S
-
Производство индола
-
Использование цитрата
-
Гидролиз крахмала
- или слабый
Рост при 37o
-
Рост 7 % NaCl
-
Гидролиз желатина
-
Гидролиз эскулина
+
Кислота из:
— Глицерин
-
— Лактоза
- или слабый
— Рамноза
-
— Салицин
(1) Альтернативный метод экстракции предложен Динесеном, 1984.
(2) Имеются данные (Janse and Van Vaerenberg, 1987), что замораживание может снизить жизнеспособность Corynebacterium sepedonicum. Суспензия гранулы в 10% глицерине может решить эту проблему.
Приложение 1
СОСТАВ МАСЕРИРУЮЩЕЙ ЖИДКОСТИ, РЕКОМЕНДОВАННЫЙ ЛЕЛЛИОТОМ И СЕЛЛАРОМ, 1976 г.
Силиконовый пеногаситель DC C MS A (Hopkins & Williams Ltd, кат. № 9964-25, Chadwell Heath, Эссекс, Англия)
10 мл
Lubrol W хлопья (ICI Ltd)
0,5 г
Тетра-пирофосфат натрия
1 г
0,05 М фосфатно-солевой буфер pH 7,0 (Приложение 2)
1 литр
Приложение 2
БУФЕРЫ
0,05 М фосфатно-солевой буфер pH 7,0
Этот буфер можно использовать для мацерации тканей клубня (2.1).
Na2HPO4
4,26 г
Х2ПО4
2,72 г
NaCl
8,0 г
Дистиллированная вода до
1 литр
0,01 М фосфатно-солевой буфер pH 7,2
Этот буфер используется для разведения антисыворотки и промывания слайдов IF.
Na2HPO4 12 H2O
2,7 г
NaH2PO4 2 H2O
0,4 г
NaCl
8,0 г
Дистиллированная вода до
1 литр
0,1 М фосфатно-забуференный глицерин pH 7,6
Этот буфер используется в качестве среды для усиления флуоресценции в тесте IF.
Na2HPO4 12 H2O
3,2 г
NaH2PO4 2 H2O
0,15 г
Глицерин
50 мл
Дистиллированная вода
100 мл
Приложение 3
МЕТОДИКА ОКРАШИВАНИЯ ПО ГРАММУ (МОДИФИКАЦИЯ ХАКЕРА) (DOETSCH, 1981)
Раствор кристаллического фиолетового
2 г кристаллического фиолетового растворяют в 20 мл 95 % этанола.
0,8 г оксалата аммония растворяют в 80 мл дистиллированной воды.
Смешайте два раствора.
йод Люголя
Йод
1 г
Йодистый калий
2 г
Дистиллированная вода
300 мл.
Твердые частицы измельчите пестиком и ступкой. Добавьте в воду и перемешайте до растворения в закрытой посуде.
Раствор для окрашивания сафранина
Основной раствор:
Сафранин О
2,5 г
95 % этанол
100 мл.
Перемешать и хранить.
Разбавьте: 1:10 для получения рабочего раствора.
Процедура окрашивания
1.
Приготовьте мазки, высушите на воздухе и зафиксируйте нагреванием.
2.
Залейте предметное стекло раствором кристаллического фиолетового на одну минуту.
3.
Ненадолго промойте водопроводной водой.
4.
Залить йодом Люголя на одну минуту.
5.
Промойте водопроводной водой и промокните насухо.
6.
Обесцвечивают 95%-ным этанолом, добавляемым по каплям, пока цвет не перестанет исчезать, или погружают при осторожном перемешивании на 30 секунд.
7.
Промойте в водопроводной воде и промокните насухо.
8.
Залейте раствором сафранина на 10 секунд.
9.
Промойте водопроводной водой и промокните насухо.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий цвет; Грамотрицательные бактерии окрашиваются в розово-красный цвет.
Приложение 4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ЕСЛИ-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Площадь поверхности (S) окна многоточечного слайда
Где D = диаметр окна. Площадь поверхности объективного поля
где d = диаметр поля.
Рассчитайте d либо прямым измерением, либо по следующей формуле:
где
я
"="
коэффициент поля (зависит от типа окуляра и варьируется от 8 до 24),
К
"="
коэффициент трубки (1 или 1,25),
г
"="
увеличение 100×, 40× и т.д.) объектива,
из (2)
из (3)(4)
Подсчитайте количество типичных флуоресцентных клеток в поле (с).
Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на окно (С).
Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на мл осадка (N)
где
й
"="
объем пеллет на окне,
где
Ф
"="
коэффициент разбавления пеллет.
Приложение 5
БАКЛАЖАНЫ КУЛЬТУРА
Посейте семена баклажанов (Solarium melongena сорт Black Beauty) в пастеризованный семенной компост. Пересадите саженцы с полностью разросшимися семядолями (на 10–14 дней) в пастеризованный горшечный компост.
Используйте баклажаны на стадии 3 листьев, когда два, но не более трех листьев полностью развернулись.
Баклажаны следует выращивать в теплице при следующих условиях окружающей среды:
продолжительность дня:
14 часов или естественная продолжительность дня, если она больше;
температура: день:
от 21 до 24°С,
ночь:
15°С.
Примечание: C. sepedonicum не будет расти при температуре >30°C. Если ночная температура не опустится до 15°С, может произойти повреждение хромофора (серебристый некроз).
Повреждение корней, вызванное личинками сциарид, можно устранить применением соответствующего инсектицида.
Баклажан сорт. Черную красавицу можно получить:
1.
АБ Хамменхёгс Фрё,
270 50 Хамменхёг,
Швеция;
2.
ХЕРСТ Сидс Лтд.,
Авеню Роуд,
Уитэм,
Эссекс CM8 2DX,
Англия;
3.
АСГРО Италия Сп А,
Корсо Лоди, 23 года,
Милан;
4.
КУППЕР
Миттельдойче Самен ГмбХ,
Гессенринг 22,
D-37269 Эшвеге
Приложение 6
СРЕДА ДЛЯ РОСТА И ИЗОЛЯЦИИ C. SEPEDONICUM
Питательный агар (НА)
Питательный агар Difco-bacto на дистиллированной воде по норме производителя. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.
Питательный декстрозный агар (NDA)
Питательный агар Difco bacto, содержащий 1 % D(+) глюкозы (моногидрат). Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 20 минут.
Дрожжево-пептонно-глюкозный агар (ЙОГА)
Дрожжевой экстракт Difco Bacto (№ 0127)
5 г
Дифко Бакто Пептон (№ 0118)
5 г
D(+)-глюкоза (моногидрат)
10 г
Очищенный агар Difco Bacto (№ 0560)
15 г
Дистиллированная вода
1 литр
Стерилизуйте объем среды объемом 0,5 литра автоклавированием при температуре 115°С в течение 20 минут.
Среда с минеральными солями дрожжевого экстракта (YGM)
Экстракт дрожжей Дифко
2,0 г
D(+)-глюкоза (моногидрат)
2,5 г
К2HPO4
0,25 г
Х2ПО4
0,25 г
MgSO4. 7H2O
0,1 г
МnSO4. H2O
0,015 г
NaCl
0,05 г
Фесох. 7X2O
0,005 г
Агар дифко-бакто очищенный
18 г
Дистиллированная вода
1 литр
Стерилизуйте объем среды объемом 0,5 литра автоклавированием при температуре 115°С в течение 20 минут.
Приложение 7
ПИТАТЕЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ C. SEPEDONICUM
Все среды следует инкубировать при температуре 21°С и исследовать через шесть дней. Если роста не произошло, инкубируйте до 20 дней.
— Окислительный и ферментативный тест (Hugh & Leifson), 1953) - O/F-тест.
Базальная среда:
КСl
0,2 г
MgSO4. 7H2O
0,2 г
NH4H2PO4
1,0 г
Диффко с пептоном
1,0 г
Агар дифко-бакто очищенный
3,0 г
D(+)-глюкоза (моногидрат)
10,0 г
Бромтимоловый синий
0,03 г
Дистиллированная вода
1 литр
Смешайте и доведите pH до значения от 7,0 до 7,2 с помощью 1 н. КОН.
Разлить в культуральные пробирки Pyrex размером 16 x 100 мм (емкостью 12 мл) по 5 мл и 10 мл.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 10 минут.
Укол инокулируют в пробирки емкостью 5 мл и 10 мл для каждой культуры. В асептических условиях добавьте 1–2 мл стерильного жидкого парафина в пробирку емкостью 10 мл. Инкубировать.
Положительная реакция:
Трубка
Цвет
Интерпретация
Открыть
Желтый
Ферментативный
Закрыто
Желтый
Открыть
Желтый
окислительный
Закрыто
Цвет морской волны
Открыть
Зеленоватый
Окислительный или инертный
Закрыто
Цвет морской волны
— Оксидазный тест (Ковач, 1956 г.)
Реагент Ковачоксидазы:
1 % водный раствор тетраметилпарафенилендиамина дигидрохлорида (BDH № 30386) в дистиллированной воде.
Этот реагент должен быть свежеприготовленным в объеме 1 мл или храниться в бутылке из коричневого стекла при температуре 5 oC в течение 1–4 недель.
Поместите каплю реагента на фильтровальную бумагу в чистую чашку Петри. Немедленно сотрите часть тест-культуры с питательного агара с помощью платиновой петли.
Положительная реакция: появление фиолетового окрашивания в течение 10 секунд. Культуры со временем от 10 до 30 секунд являются слабоположительными.
Примечание: Крайне важно использовать платиновую петлю и культуры NA, поскольку следы железа или высокое содержание сахара в питательной среде могут дать ложноположительные результаты.
— Производство кислоты из лактозы, рамнозы, салицина, глицерина
Приготовьте среду O/F Хью и Лейфсона без глюкозы. Разлить в пробирки по 5 мл. Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 10 минут. К расплавленной основе при 45°С в асептических условиях добавляют 0,5 мл простерилизованных фильтрованием 10 % водных растворов глицерина, лактозы, рамнозы или салицина. Аккуратно перемешайте.
Положительная реакция: изменение цвета с сине-зеленого на желтый указывает на выделение кислоты.
— Тест каталазы
Поместите каплю перекиси водорода (объем 30) на чистое предметное стекло и эмульгируйте с петлей культуры, используя платиновую петлю.
Положительная реакция: образование пузырьков кислорода в капле указывает на присутствие каталазы.
— Активность нитратредуктазы и денитрификация (Брэдбери, 1970).
Культуральная среда:
KNO3 (без нитритов)
1 г
Экстракт дрожжей Дифко
1 г
К2HPO4
5 г
Дистиллированная вода
1 литр
Разлить по 10 мл во флаконы по 20 мл. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.
Реагент А:
H2SO4
8 г
5N уксусная кислота
1 литр
Реагент Б:
нафтиламин
5 г
5N уксусная кислота
1 литр
Инокулируйте нитратную среду в двух экземплярах. Проверьте через 10 и 20 дней, добавив одну каплю йода Люголя, 0,5 мл реактива А и 0,5 мл реактива Б. Если среда не становится красноватой, добавьте примерно 50 мг цинкового порошка. Наблюдайте за цветовой реакцией.
Положительная реакция:
Цветовая реакция
Этап 1
Этап 2
Нет снижения нитратов
бесцветный
красный
Восстановление нитратов до нитритов (только нитратредуктаза)
красный
—
Восстановление нитратов сверх нитритов (денитрификация — нитрат- и нитритредуктазой)
бесцветный
бесцветный
— Производство уреазы (Леллиотт, 1966).
Базальная среда:
Основа оксоидно-мочевинного агара (CM53)
2,4 г
Дистиллированная вода
95 мл
Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 20 минут. Охладите расплавленную основу до 50 oC и асептически добавьте 5 мл стерилизованного фильтрованием 40% водного раствора мочевины (Oxoid SR20). Хорошо перемешать.
Распределите по 6 мл в стерильные пробирки (16 x 100 мм) и дайте застыть в виде наклонов с хорошим торцом.
Положительная реакция: желто-оранжевая среда приобретает вишнево-красную или пурпурно-розовую окраску, если наблюдается активность уреазы.
Использование цитрата (Кристенсен) (Скерман, 1967)
Основа цитратного агара (Merck 2503)
23 г
Дистиллированная вода
1 литр
Перемешать и растворить при нагревании. Разливают в объемы по 6 мл, как для среды с мочевиной. Стерилизовать автоклавированием при 121 oC в течение 15 минут и дать застыть в виде наклонов.
Положительная реакция: об утилизации цитрата свидетельствует изменение цвета среды с оранжевого на красный.
- Производство сероводорода (Рамамурти, 1959 г.)
Середина:
Дифко Бакто Триптон (№ 0123)
10 г
К2HPO4
1 г
NaCl
5 г
Дистиллированная вода
1 литр.
Растворить и разлить по 6 мл в пробирки размером 16 х 100 мм. Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 10 минут.
Инокулируйте и асептически подвешивайте к краю пробирки бумагу из ацетата свинца (Merck 9511). Зафиксируйте колпачком. Инкубируйте до 20 дней.
Положительная реакция: на образование H2S из триптона указывает появление черно-коричневой окраски тестовой бумаги.
— Indullo Production (Рамамурти, 1959)
Середина:
Что касается теста H2S.
Удалите свинцово-ацетатную бумагу, добавьте 1–2 мл диэтилового эфира и осторожно встряхните. Дайте слоям разделиться (пять минут). Осторожно добавьте 0,5 мл реагента Ковача (Merck 9293) внутрь наклонной пробирки.
Положительная реакция: на присутствие индола указывает появление красного цвета в желтом слое между эфирной и водной фракциями.
- Звезда роста 37 (Рамамурти, 1959)
Середина:
Питательный бульон Difco bacto (№ 0003)
8 г
Дистиллированная вода
1 литр
Смешать, растворить и распределить в пробирки по 6 мл.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.
Инокулировать и инкубировать при 37°С.
Положительная реакция: ищите рост.
— Рост 7 % хлорида натрия (Рамамурти, 1959)
Середина:
Питательный бульон Difco bacto
8 г
NaCl
70 г
Дистиллированная вода
1 литр
Смешать, растворить и распределить в пробирки по 6 мл.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.
Положительная реакция: ищите рост.
— Гидролиз желатина (Lelliott, Billing & Hayward, 1966)
Середина:
Желатин Difco Batto (№ 0143)
120 г
Дистиллированная вода
1 литр
Смешать, растворить нагреванием и распределить по 6 мл в пробирки.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.
Положительная реакция: разжижение желирующего вещества даже при выдержке при 5°С в течение 30 минут.
— Гидролиз крахмала
Середина:
Питательный агар Difco Bacto (расплавленный)
1 литр
Дифко-бакторастворимый крахмал (№ 0178)
2 г
Перемешать, стерилизовать автоклавированием при 115 оС в течение 10 минут.
Налейте тарелки. Точечно инокулируют чашки.
После того, как произойдет хороший рост (через 10–20 дней), удалите часть нароста и залейте йодом Люголя.
Положительная реакция: на гидролиз крахмала указывают светлые зоны под или вокруг роста бактерий; остаток среды окрашивается в фиолетовый цвет.
— Активность эскулингидролазы (Sneath & Collins, 1974)
Середина:
Диффко с пептоном
10 г
Эскулин
1 г
Цитрат железа (Merck 3862)
0,05 г
Цитрат натрия
1 г
Дистиллированная вода
1 литр
Перемешать до растворения и распределить в пробирки по 6 мл.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 115°С в течение 10 минут.
Среда прозрачная, но имеет голубоватую флуоресценцию.
Положительная реакция: на гидролиз эскулина указывает появление коричневого цвета с исчезновением флуоресценции. Проверить это можно с помощью ультрафиолетовой лампы.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Брэдбери, Дж. Ф., 1970. Выделение и предварительное изучение бактерий из растений. Преподобный ПИ. Путь., 49, 213-218.
Динесен И.Г., 1984. Выделение и диагностика Corynebacterium sepedonicum из больных клубней картофеля. Бюллетень ЕОКЗР. 14 (2), 147–152.
Доетч Р. Н., 1981. Детерминирующие методы световой микроскопии. В: Руководство по методам общей бактериологии, Американское общество микробиологии, Вашингтон, 21–23.
Хью Р. и Лейфсон Ф., 1953. Таксономическое значение ферментативного и окислительного метаболизма углеводов различными грамотрицательными бактериями. Ж. Бакт., 66, 24-26.
Янс, Дж. Д. и Дж. Ван Веренберг. Интерпретация метода ЕС для выявления скрытой кольцевой гнили (Corynebacterium sepedonicum) картофеля. Бюллетень ЕОКЗР, № 17, 1987 г., стр. 1-10.
Ковач Н., 1956. Идентификация Pseudomonas pyocyanea с помощью оксидазной реакции. Природа, Лондон, 178, 703.
Леллиотт Р.А., 1966. Коринеформные бактерии, патогенные для растений. Дж. прил. Бакт., 29, 114-118.
Леллиотт, Р.А., Э. Биллинг и А.К. Хейворд, 1966. Определяющая схема для флуоресцентных патогенных псевдомонад растений J. appl. Бакт., 29, 470–489.
Леллиотт, Р.А. и П.В., Селлар, 1976. Обнаружение скрытой кольцевой гнили (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) в подвоях картофеля. Бюллетень ЕОКЗР, 6(2).
Рамамурти, К.С., 1959. Сравнительные исследования некоторых грамположительных фитопатогенных бактерий и их связи с коринебактериями. Память Корнеллский сельскохозяйственный завод. Эксп. Ста., 366, 52 с.
Скерман В.Б.Д., 1967. Руководство по определению родов бактерий. 2-е изд., Компания Уильяма и Уилкинса, Балтимор.
Снит, П.Х.А. и В.Г. Коллинз, 1974. Исследование воспроизводимости тестов между лабораториями: отчет рабочей группы по Pseudomonas. Антони ван Левенгук, 40 лет, 481–527.
ПРИЛОЖЕНИЕ II
1.
Для каждого подозреваемого случая, для которого был выявлен положительный результат иммунофлуоресцентного теста в соответствии с методом, изложенным в Приложении I, и ожидается подтверждение или опровержение путем выполнения указанного метода, должно быть сохранено и надлежащим образом сохранено:
—
все клубни или растения, где это возможно, отбирают пробы, и
—
любой оставшийся экстракт и дополнительно подготовленные иммунофлуоресцентные слайды до завершения указанного метода.
2.
В случае положительного подтверждения наличия организма следует обеспечить сохранение и соответствующую консервацию:
—
материал, указанный в пункте 1, и
—
образец инфицированного материала баклажана, инокулированный экстрактом клубня или растения, и
изолированная культура организма,
в течение как минимум одного месяца после процедуры уведомления в соответствии со статьей 5 (2).
ПРИЛОЖЕНИЕ III
1.
Элементы, которые следует учитывать при определении степени вероятного загрязнения в соответствии со статьей 5 (1) (b), включают:
—
клубни или растения, выращенные в месте производства, обозначенном как загрязненное в соответствии со статьей 5(1)(a),
—
место(а) производства или помещения, имеющие некоторую производственную связь с клубнями или растениями, обозначенными как загрязненные в соответствии со статьей 5 (1) (а), включая те, которые совместно используют производственное оборудование и помещения напрямую или через общего подрядчика,
—
клубни или растения, произведенные в месте(ах) производства, указанном в предыдущем абзаце, или присутствующие в таком месте(ах) производства в течение периода, когда клубни или растения, обозначенные как загрязненные в соответствии со Статьей 5 (1) (а), были присутствовать в помещениях или местах производства, указанных в первом абзаце,
—
центральные склады, осуществляющие прием картофеля из вышеуказанных мест производства,
—
любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или его части, а также любые другие предметы, включая упаковочный материал, которые могли вступить в контакт с клубнями или растениями, обозначенными как загрязненные в соответствии со статьей 5 (1) (а), в течение предыдущих 12 месяцев. или где это уместно,
—
любые клубни или растения, хранящиеся или находящиеся в контакте с любыми конструкциями или объектами, перечисленными в предыдущем абзаце, до очистки и дезинфекции таких конструкций и объектов, и
—
должны включать в результате испытаний в соответствии со статьей 6 клубни или растения того же клонального происхождения, что и клубни или растения, признанные загрязненными в соответствии со статьей 5 (1) (а), и для которых исследования показывают вероятность заражения.
2.
Элементы, которые следует учитывать при определении возможного распространения в соответствии со статьей 5 (1) (c), включают:
—
близость других мест производства картофеля или других растений-хозяев,
—
общность запасов семенного картофеля.
3.
Подробности уведомления, упомянутого в первом подпункте статьи 5 (2), включают:
—
для любой партии или партии картофеля, обозначенной как загрязненная, сертификаты, предусмотренные статьями 7 или 8 Директивы 77/93/ЕЕС, паспорт или регистрационный номер, в зависимости от обстоятельств,
—
название сорта для подвоев семенного картофеля и, где это возможно, во всех других случаях,
—
описание элементов обозначенного загрязнения и разграничение зон,
—
наличие экстракта, подготовленных иммунофлуоресцентных препаратов, инфицированного материала баклажанов и выделенной культуры организма из теста, в котором получено положительное подтверждение микроорганизма.
ПРИЛОЖЕНИЕ IV
1.
Официально контролируемые меры, указанные в Статье 7 (1), по удалению клубней или растений, признанных загрязненными в соответствии со Статьей 5 (1) (а), должны быть:
—
использование для промышленной переработки путем прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с соответствующими установками для удаления отходов, для которых установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма, и с системой дезинфекции мест хранения и выезжающих транспортных средств, или
—
другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры должны быть доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.
2.
Надлежащее использование или утилизация клубней или растений, определенных как вероятно загрязненные в соответствии со статьей 5 (1) (b) и указанных в статье 7 (2), под контролем ответственных официальных органов государств-членов, должно быть:
—
использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для потребления, упакованного для непосредственной доставки и использования без переупаковки и предназначенного для такой непосредственной доставки и использования, или
—
использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для промышленной переработки и предназначенного для прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с соответствующими средствами утилизации и дезинфекции отходов, или
—
какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма.
3.
Соответствующими методами очистки и дезинфекции объектов, указанных в статье 7 (3), должны быть те, для которых установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма, и они должны применяться под надзором ответственных официальных органов государства-члены.
4.
Ряд мер, которые должны быть реализованы государствами-членами в пределах демаркированной зоны, установленной в соответствии со статьей 5 (1) (c) и упомянутой в статье 7 (4), должен включать:
4.1.
в местах производства, обозначенных как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(а):
(а)
в поле, обозначенном как загрязненное в соответствии со статьей 5 (1) (а), либо
(я)
—
в течение как минимум трех вегетационных лет, следующих за годом указанного загрязнения,
—
должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других растений-хозяев, встречающихся в природе, и
—
клубни картофеля, растения или настоящие семена или другие растения-хозяева этого организма, встречающиеся в природе, или культуры, для которых существует выявленный риск выживания или распространения организма, не должны высаживаться до тех пор, пока поле не будет признано свободным от растений-добровольцев картофеля в течение не более минимум два последовательных года выращивания,
—
в первый сезон выращивания картофеля, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, официально сертифицированный семенной картофель должен быть высажен только для производства товаров, и должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2 (1);
—
в сезоне сбора урожая картофеля, следующем за сезоном, указанным в предыдущем абзаце, и после соответствующего цикла севооборота, официально сертифицированный семенной картофель должен быть высажен либо для производства семян, либо для производства продовольственных товаров, и должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2 (1); или
(ii)
—
в течение четырех лет выращивания, следующих за годом указанного загрязнения,
—
должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля и других растений-хозяев, встречающихся в природе, и
—
поле должно быть заложено и содержаться либо под голым паром, либо на постоянных пастбищах с частыми скошенными стрижками или интенсивным выпасом,
—
в первый сезон выращивания картофеля, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, официально сертифицированный семенной картофель должен быть высажен для производства семян или продовольственных товаров, и должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2 (1);
(б)
в других областях:
—
в год вегетации после указанного загрязнения:
—
либо клубни картофеля, растения или настоящие семена или другие растения-хозяева данного организма, встречающиеся в природе, не высаживаются, и должны быть приняты меры по уничтожению растений-добровольцев картофеля, в зависимости от обстоятельств, или
—
официально сертифицированный семенной картофель может быть посажен только для производства продовольственных товаров при условии, что ответственные официальные органы удостоверятся, что риск появления добровольных растений картофеля и других растений-хозяев организма, обнаруженных естественным путем, устранен,
—
поскольку, по крайней мере, в течение двух лет выращивания, следующих за указанным в предыдущем абзаце, следует сажать только официально сертифицированный семенной картофель для производства семян или продуктов,
—
в каждый год выращивания, упомянутый в предыдущих абзацах, должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и естественных растений-хозяев организма, а также должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2 (1),
—
если официально сертифицированный семенной картофель высаживается для производства продовольственных товаров в год выращивания, следующий за установленным заражением, растущая культура должна быть проверена в соответствующие сроки, а добровольные растения картофеля должны быть проверены на наличие данного организма;
(с)
сразу после определения загрязнения в соответствии со Статьей 5(1) (а) и в каждый из последующих лет выращивания вплоть до первого разрешенного сезона выращивания картофеля включительно на поле(ях), обозначенном как загрязненное, как подробно описано в пункте (а) , все оборудование и складские помещения на месте производства, задействованные в производстве картофеля, должны быть очищены и продезинфицированы соответствующим образом и с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3;
(г)
в тех производственных системах, где возможна полная замена питательной среды,
—
клубни, растения или настоящие семена нельзя высаживать, если на производственном объекте не были приняты официально контролируемые меры по уничтожению организма и удалению любого картофеля или другого пасленового материала, включая, по крайней мере, полную замену питательной среды, а также очистку и дезинфекцию производственное подразделение и все оборудование, и впоследствии было получено разрешение на производство картофеля от ответственных официальных органов, и
—
производство картофеля должно производиться из официально сертифицированного семенного картофеля или из мини-клубней или микрорастений, полученных из проверенных источников;
4.2.
в пределах демаркированной зоны, без ущерба для мер, подробно описанных в пункте 4.1, государства-члены должны:
(а)
немедленно и в течение не менее трех вегетационных периодов после указанного загрязнения:
—
обеспечивать надзор со стороны своих ответственных должностных лиц за помещениями по выращиванию, хранению или обращению с клубнями картофеля, а также за помещениями, в которых эксплуатируется картофельная техника по договору,
—
требовать очистки и дезинфекции оборудования и складов в таких помещениях, в зависимости от обстоятельств, и с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3,
—
требовать посадки сертифицированных семян только для всех культур картофеля в этой зоне,
—
требовать раздельного обращения с заготовленным семенным фондом и товарным запасом во всех помещениях зоны,
—
провести официальный опрос, как подробно описано в Статье 2 (1);
(б)
разработать программу, где это возможно, для замены всех запасов семенного картофеля в течение соответствующего периода времени.
Меры, реализованные в соответствии с 4.2, наряду с регистрационными номерами производителей, коллективных складов и центров отправки в демаркированной зоне, должны ежегодно доводиться до сведения других государств-членов и Комиссии.
Вершина
Директивы по годам
- 2024
- 2023
- 2022
- 2021
- 2020
- 2019
- 2018
- 2017
- 2016
- 2015
- 2014
- 2013
- 2012
- 2011
- 2010
- 2009
- 2008
- 2007
- 2006
- 2005
- 2004
- 2003
- 2002
- 2001
- 2000
- 1999
- 1998
- 1997
- 1996
- 1995
- 1994
- 1993
- 1992
- 1991
- 1990
- 1989
- 1988
- 1987
- 1986
- 1985
- 1984
- 1983
- 1982
- 1981
- 1980
- 1979
- 1978
- 1977
- 1976
- 1975
- 1974
- 1973
- 1972
- 1971
- 1970
- 1969
- 1968
- 1967
- 1966
- 1965
- 1964
- 1963
- 1962
- 1961
- 1960
- 1959