Директива Совета 98/57/EC от 20 июля 1998 г. о контроле над Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

ДИРЕКТИВА СОВЕТА 98/57/EC от 20 июля 1998 г. о борьбе с Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

СОВЕТ ЕВРОПЕЙСКОГО СОЮЗА,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества, и в частности его статью 43,

Принимая во внимание предложение Комиссии (1),

Принимая во внимание мнение Европейского парламента (2),

Принимая во внимание мнение Экономического и социального комитета (3),

В то время как вредный организм Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. ранее был известен как Pseudomonas solanacearum (Смит) Смит; тогда как Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. вероятно, станет общепринятым названием организма; поскольку настоящая Директива должна учитывать это научное развитие;

Принимая во внимание, что производство картофеля и томатов занимает важное место в сельском хозяйстве Сообщества; тогда как урожай картофеля и томатов постоянно находится под угрозой со стороны вредных организмов;

Принимая во внимание, что посредством защиты выращивания картофеля и томатов от таких вредных организмов следует не только поддерживать производственный потенциал, но и повышать продуктивность сельского хозяйства;

Принимая во внимание, что защитные меры по предотвращению проникновения вредных организмов на территорию государства-члена имели бы лишь ограниченный эффект, если бы такие организмы не контролировались одновременно и методично на всей территории Сообщества и не предотвращались от распространения;

Принимая во внимание, что одним из вредных организмов на картофеле и томатах является Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., возбудитель болезни бурой гнили картофеля и бактериального увядания картофеля и томатов; поскольку вспышки заболеваний, вызванных этим патогеном, произошли в некоторых частях Сообщества, и некоторые ограниченные источники инфекции все еще существуют;

Принимая во внимание, что существует значительный риск для выращивания картофеля и томатов на всей территории Сообщества, если в отношении этих культур не будут приняты эффективные меры по обнаружению этого организма и определению его распространения, предотвращению его возникновения и распространения, а в случае обнаружения - предотвратить его распространение и контролировать его с целью искоренения;

Принимая во внимание, что для обеспечения этого внутри Сообщества должны быть приняты определенные меры; поскольку государства-члены должны, кроме того, иметь возможность принимать дополнительные или более строгие меры, когда это необходимо, при условии, что нет никаких препятствий для перемещения картофеля или томатов внутри Сообщества, за исключением случаев, установленных Директивой Совета 77/93/EEC от 21 декабря 1976 г. о защитных мерах против ввоза в Сообщество организмов, вредных для растений или растительных продуктов, и против их распространения внутри Сообщества (4); поскольку о таких мерах необходимо уведомлять другие государства-члены и Комиссию;

Принимая во внимание, что меры должны учитывать, что для обнаружения возбудителя необходимы систематические официальные обследования; поскольку такие обследования должны включать в себя процедуры проверки и, при необходимости, учитывая, что при определенных условиях окружающей среды болезнь может оставаться латентной и незамеченной как в растущем урожае картофеля, так и в хранящихся клубнях картофеля, должны включать процедуры отбора проб и тестирования; поскольку распространение возбудителя внутри растущей культуры не является наиболее важным фактором, но поскольку возбудитель может распространяться поверхностными водами и некоторыми связанными с ними дикими растениями пасленовых, и, следовательно, орошение посевов картофеля и томатов загрязненной водой, по-видимому, представляет риск для заражение таких культур; тогда как возбудитель также может существовать в течение зимы в самосевных (добровольных) растениях картофеля и томата, и они могут быть источником инфекции, переносимой из одного сезона в другой; поскольку возбудитель распространяется также при контаминации картофеля при контакте с инфицированным картофелем, а также при контакте с оборудованием для посадки, сбора и обработки урожая или контейнерами для транспортировки и хранения, которые были контаминированы организмом в результате предыдущего контакта с инфицированным картофелем;

Принимая во внимание, что распространение возбудителя можно уменьшить или предотвратить путем обеззараживания таких объектов; поскольку любое подобное заражение семенного картофеля представляет собой серьезный риск распространения патогена; аналогичным образом, латентная инфекция семенного картофеля представляет собой серьезный риск распространения возбудителя, и это можно предотвратить путем использования семенного картофеля, произведенного в рамках официально утвержденной программы, в соответствии с которой семенной картофель был проверен и признан свободным от инфекции;

Принимая во внимание, что современные знания биологии и эпидемиологии Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. в европейских условиях является неполным, и ожидается, что пересмотр предлагаемых мер будет необходим в течение нескольких сезонов; аналогичным образом ожидается улучшение процедуры испытаний в свете дальнейших исследований, особенно чувствительности и специфичности методов испытаний, с целью выбора и стандартизации доступных оптимальных методов испытаний;

Принимая во внимание, что для определения деталей таких общих мер, а также более строгих или дополнительных мер, принимаемых государствами-членами для предотвращения заноса возбудителя на их территорию, желательно, чтобы государства-члены тесно сотрудничали с Комиссией в течение Постоянный комитет по здоровью растений (далее именуемый «Комитет»),

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Настоящая Директива касается мер, которые должны быть приняты в государствах-членах против Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., ранее известной как Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (далее именуемой «организм»), чтобы, в отношении к растениям-хозяевам организма, перечисленного в Разделе 1 Приложения I (далее именуемые «внесенный в список растительный материал»):

(а) найти его и определить его распространение;

(б) предотвратить его возникновение и распространение; и

(c) в случае обнаружения предотвратить его распространение и контролировать его с целью искоренения.

Статья 2

1. Государства-члены должны проводить ежегодные систематические официальные исследования организма на включенном в список растительном материале, происходящем с их территории. Чтобы выявить другие возможные источники загрязнения, угрожающие производству перечисленного растительного материала, государства-члены должны провести оценку риска и, если в ходе этой оценки не выявлен риск распространения организма, они должны в производственных зонах перечисленного растительного материала, проводить целевые официальные обследования организма на растениях, не включенных в перечень растительного материала, включая дикие растения-хозяева пасленовых, а также на поверхностных водах, которые используются для орошения или опрыскивания перечисленного растительного материала, и на жидких отходах, сбрасываемых помещения для промышленной переработки или упаковки, работающие с включенным в список растительным материалом и используемые для орошения или опрыскивания включенного в список растительного материала. Объем таких целевых обследований определяется в зависимости от выявленного риска. Государства-члены могут также проводить официальные исследования на наличие данного организма на материалах, таких как среда выращивания, почва и твердые отходы промышленных перерабатывающих или упаковочных предприятий.

2. Официальные освидетельствования, предусмотренные пунктом 1, проводятся:

(a) для включенного в список растительного материала, в соответствии с подробностями, изложенными в пункте 1 Раздела II Приложения I; и,

(b) для растений-хозяев, кроме включенного в список растительного материала, и для воды, включая жидкие отходы, в соответствии с соответствующими методами и, при необходимости, должны быть взяты пробы и подвергнуты официальным или официально контролируемым лабораторным испытаниям;

(c) если применимо, для другого материала, в соответствии с соответствующими методами.

Для этих исследований дальнейшие детали процедур проверки, а также количество, происхождение, стратификация и сроки сбора проб должны быть определены ответственными официальными органами в значении Директивы 77/93/EEC на основе надежных научных и статистических принципов и биологию организма и принимая во внимание в соответствующем государстве-члене конкретные системы производства указанного растительного материала и, при необходимости, других растений-хозяев организма.

3. Подробности и результаты официальных обследований, предусмотренных в параграфе 1, должны ежегодно сообщаться другим государствам-членам и Комиссии в соответствии с положениями пункта 2 Раздела II Приложения I. Эти уведомления должны быть представлены 1 июня, за исключением картофеля, используемого в качестве семян, сохраняемых в хозяйстве, уведомление о котором должно быть подано до 1 сентября. Подробности и результаты по культурам должны быть связаны с производством предыдущего года. Подробная информация об этих уведомлениях может быть представлена ​​Комитету.

4. Следующее положение должно быть принято в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:

- соответствующие методы исследований и лабораторных исследований, предусмотренные в пункте 2, первый подпункт (b).

5. Следующие положения могут быть приняты в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:

- соответствующие методы обследований, предусмотренные в пункте 2, первый подпункт (с),

- дополнительные подробности обследований, предусмотренных в пункте 2, второй подпараграф, с целью обеспечения сопоставимых уровней уверенности между государствами-членами.

Статья 3

Государства-члены должны гарантировать, что о подозрении или подтвержденном присутствии организма на их территории будет сообщено их собственным ответственным официальным органам.

Статья 4

1. В каждом случае подозрения на происшествие ответственные официальные органы соответствующего государства(ов)-членов должны обеспечить завершение официального или официально контролируемого лабораторного тестирования с использованием для внесенного в список растительного материала соответствующего метода, изложенного в Приложении II и в соответствии с с условиями, указанными в пункте 1 Приложения III, или, во всех других случаях, любым другим официально одобренным методом, чтобы подтвердить или опровергнуть предполагаемое событие. В случае подтверждения применяются требования, изложенные в пункте 2 Приложения III.

2. До подтверждения или опровержения подозрительного события согласно параграфу 1, в каждом случае подозрительного события, когда:

(i) были замечены диагностические симптомы заболевания, вызванного данным микроорганизмом, и получен положительный результат в экспресс-тесте(ах), как указано в разделе I, пункте 1 и разделе II Приложения II; или,

(ii) был получен положительный результат в скрининговом тесте(ах), как указано в Приложении II, раздел I, пункт 2 и раздел III,

Ответственные официальные органы государств-членов обязаны в отношении собственного производства:

(a) запретить перемещение растений и клубней всех культур, партий или партий, из которых были взяты пробы, за исключением случаев, когда они находятся под их контролем и при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма;

(b) принять меры по выяснению происхождения предполагаемого происшествия;

(c) ввести соответствующие дополнительные меры предосторожности, исходя из уровня предполагаемого риска, особенно в отношении производства перечисленного растительного материала и перемещения партий семенного картофеля, отличных от тех, которые указаны в пункте (a), произведенных на месте производства из которого были взяты пробы, указанные в пункте (а), во избежание любого распространения организма.

3. В тех случаях подозрения на происшествие, когда существует риск загрязнения внесенного в список растительного материала или поверхностных вод из или в другое государство(а)-члена ЕС, государство-член, в котором было сообщено о подозрительном происшествии, должно немедленно уведомить об этом, в соответствии с выявленный риск, подробности упомянутого предполагаемого происшествия другому заинтересованному государству-члену(ам), и между указанными государствами-членами будет обеспечено соответствующее сотрудничество. Государство-член(ы), уведомленное(ые) таким образом, должно ввести меры предосторожности в соответствии с параграфом 2(c) и предпринять любые дальнейшие действия, при необходимости, в соответствии с параграфами 1 и 2.

4. Следующее положение может быть принято в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:

- меры, указанные в пункте 2(c).

Статья 5

1. Если официальное или официально контролируемое лабораторное исследование с использованием для внесенного в список растительного материала соответствующего метода, указанного в Приложении II, или, во всех других случаях, любого другого официально одобренного метода, подтверждает присутствие организма в пробе, взятой в соответствии с Согласно настоящей Директиве, ответственные официальные органы государства-члена, принимая во внимание обоснованные научные принципы, биологию организма и конкретные системы производства, маркетинга и переработки растений-хозяев организма в этом государстве-члене, должны:

(a) для включенного в перечень растительного материала;

(i) начать расследование для определения степени и основного источника(ов) загрязнения в соответствии с положениями Приложения IV, с дальнейшим тестированием в соответствии со Статьей 4(1), по крайней мере, на всем клонально родственном семенном картофеле акции и,

(ii) обозначать как загрязненные перечисленный растительный материал, партию и/или партию, из которой был взят образец, а также оборудование, транспортное средство, сосуд, хранилище или их агрегаты, а также любые другие объекты, включая упаковочный материал, которые находились в контакте с указанный растительный материал, из которого был взят образец; также обозначать как загрязненные, где это применимо, поле(я), единицу(ы) выращивания защищенных культур и место(а) производства, из которых был собран указанный растительный материал и из которого был взят образец; а для проб, взятых в вегетационный период, обозначить как загрязненные поле(а), место(а) производства и, при необходимости, единицу(ы) защищенного растениеводства, из которой был взят образец, и,

(iii) определить, в соответствии с положениями пункта 1 Приложения V, степень вероятного заражения через контакт до или после сбора урожая, через производственные, ирригационные или опрыскивающие связи или через клональную связь с указанным загрязнением, и,

(iv) разграничить зону на основе обозначения загрязнения в соответствии с пунктом (ii), определения степени вероятного заражения в соответствии с пунктом (iii) и возможного распространения организма в соответствии с положениями пункта 2. (i) Приложения V;

(b) для культур растений-хозяев, отличных от упомянутых в пункте (a), если производство перечисленного растительного материала идентифицировано как находящееся под угрозой,

(i) начать расследование в соответствии с пунктом (a)(i); и

(ii) обозначать контаминированные растения-хозяева организма, из которого был взят образец; и

(iii) определить вероятное загрязнение и разграничить зону в соответствии с пунктами (a)(iii) и (iv) соответственно в отношении производства перечисленного растительного материала;

(c) для поверхностных вод (включая сбросы жидких отходов от предприятий по промышленной переработке или упаковке, обрабатывающих списочный растительный материал) и связанных с ними диких пасленовых растений-хозяев, где производство списочного растительного материала выявлено под угрозой из-за орошения, опрыскивания или затопления поверхности вода,

(i) провести расследование, включая официальное обследование в соответствующее время проб поверхностных вод и, если таковые имеются, диких растений-хозяев пасленовых, чтобы установить степень загрязнения; и

(ii) определить как загрязненную поверхностную воду, из которой были взяты пробы(ы), в необходимой степени и на основании расследования в соответствии с пунктом (i); и

(iii) определить вероятное загрязнение и разграничить зону на основе обозначения загрязнения согласно пункту (ii) и возможного распространения организма с учетом положений пунктов 1 и 2(ii) Приложения V.

2. Государства-члены должны немедленно уведомить другие государства-члены и Комиссию в соответствии с положениями пункта 3 Приложения V о любом загрязнении, указанном в параграфах 1(a)(ii) и 1(c)(ii), а также подробные сведения о демаркации зоны согласно пункту 1(a)(iv) и, где применимо, согласно пункту 1(c)(iii). Подробная информация об уведомлении в соответствии с настоящим пунктом может быть представлена ​​Комитету.

Государства-члены должны одновременно представить Комиссии дополнительное уведомление, указанное в пункте 4 Приложения V. Подробности уведомления в соответствии с настоящим подпунктом должны быть немедленно переданы членам Комитета.

3. В результате уведомления согласно параграфу 2 и элементов, упомянутых в нем, другие государства-члены, указанные в уведомлении, должны начать расследование в соответствии с параграфом 1(a)(i) и, где применимо, параграфом 1(c)( i) и предпринять дальнейшие действия, при необходимости, в соответствии с пунктами 1 и 2.

Статья 6

1. Государства-члены должны предписать, что внесенный в список растительный материал, обозначенный как загрязненный в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii), не может быть посажен и что под контролем и одобрением их ответственных официальных органов он должен подвергаться одно из положений пункта 1 Приложения VI, таким образом, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма.

2. Государства-члены должны предписать, чтобы внесенный в список растительный материал, определенный как вероятно загрязненный в соответствии со Статьей 5(1)(a) (iii) и (c)(iii), включая внесенный в список растительный материал, для которого был выявлен риск, произведен на местах продукция, определенная как вероятно загрязненная в соответствии со Статьей 5(1)(a)(iii), не может быть засажена и должна под контролем ответственных официальных органов быть направлена ​​на соответствующее использование или утилизацию, как указано в пункте 2 Приложения VI, такие что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма.

3. Государства-члены должны предписать, чтобы любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или их части, а также любые другие объекты, включая упаковочный материал, обозначенные как загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii) или определенные как вероятно загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii) 5(1)(a)(iii) и (c)(iii), должны быть либо уничтожены, либо обеззаражены с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3 Приложения VI. После дезактивации любые такие объекты больше не будут считаться загрязненными.

4. Без ущерба для мер, реализуемых в соответствии с параграфами 1, 2 и 3, государства-члены должны предписать, чтобы в зоне, разграниченной в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv) и (c)(iii), был принят ряд мер. , как указано в пунктах 4.1 и 4.2 Приложения VI, должны быть реализованы. Подробности этих мер должны ежегодно сообщаться другим государствам-членам ЕС и Комиссии. Детали этого уведомления могут быть представлены Комитету.

Статья 7

1. Государства-члены должны предписать, что семенной картофель должен соответствовать требованиям Директивы 77/93/ЕЕС и должен быть получен непосредственно из картофельного материала, полученного в рамках официально утвержденной программы, который был признан свободным от организма в ходе официального или официально контролируемого тестирования с использованием соответствующий метод, изложенный в Приложении II.

Вышеупомянутое тестирование должно проводиться государством-членом:

(a) в случаях, когда было подтверждено обнаружение(я) организма в собственном производстве семенного картофеля,

(i) путем тестирования более ранних размножений, включая первоначальный клональный отбор и систематическое тестирование основных клонов семенного картофеля; или

(ii) в случаях, когда установлено отсутствие клонального родства, путем тестирования всех основных клонов семенного картофеля или более ранних размножений, включая первоначальный клональный отбор, и

(b) в других случаях либо на каждом растении первоначальной клоновой селекции, либо на репрезентативных образцах базового семенного картофеля или более ранних размножений.

2. Следующие положения могут быть приняты в соответствии с процедурой, изложенной в статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС:

- подробные правила применения абзаца 1 второго подпункта пункта (а),

- правила о репрезентативных пробах, предусмотренные абзацем первым подпункта второго пункта (б).

Статья 8

Государства-члены должны запретить хранение и обращение с данным организмом.

Статья 9

Без ущерба для положений Директивы 77/93/ЕЕС, государства-члены могут разрешить отступление от мер, указанных в Статьях 6 и 8 настоящей Директивы, в соответствии с положениями, изложенными в Директиве 95/44/ЕС (5) для судебного разбирательства. или научных целях, а также для работы по селекции сортов.

Статья 10

Государства-члены могут принимать в отношении своего собственного производства такие дополнительные или более строгие меры, которые могут потребоваться для борьбы с этим организмом или предотвращения его распространения, если они соответствуют положениям Директивы 77/93/ЕЕС.

Подробности этих мер должны быть доведены до сведения других государств-членов ЕС и Комиссии. Детали этого уведомления могут быть представлены Комитету.

Статья 11

Поправки к Приложениям к настоящей Директиве, вносимые в свете развития научных или технических знаний, должны быть приняты в соответствии с процедурой, установленной в Статье 16а Директивы 77/93/ЕЕС. В случае использования методов, изложенных в Приложении II, и мер, указанных в параграфах 4.1 и 4.2 Приложения VI к настоящей Директиве, Комиссия должна подготовить отчет, рассматривающий эти методы и меры в свете полученного опыта, и отчет должен быть представлен. Комитету до 1 января 2002 года.

Статья 12

1. Государства-члены должны ввести в действие законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, начиная с 21 августа 1999 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти меры, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в ​​случае их официальной публикации. Методы такой ссылки должны быть приняты государствами-членами.

2. Государства-члены должны немедленно сообщить Комиссии основные положения внутреннего законодательства, которые они принимают в области, регулируемой настоящей Директивой. Комиссия информирует об этом другие государства-члены.

Статья 13

Настоящая Директива вступает в силу в день ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 14

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 20 июля 1998 года.

Для Совета

Президент

В. МОЛЬТЕРЕР

(1) OJ C 124, 21 апреля 1997 г., с. 12 и OJ C 108, 7 апреля 1998 г., с. 85.

(2) OJ C 14, 19 января 1998 г., с. 34.

(3) OJ C 206, 7 июля 1997 г., с. 57.

(4) OJ L 26, 31 января 1977 г., с. 20. Директива с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 98/2/EC (OJ L 15, 21.1.1998, стр. 34).

(5) OJ L 184, 3 августа 1995 г., с. 34. Директива с последними поправками, внесенными Директивой Комиссии 97/46/EC (OJ L 204, 31 июля 1997 г., стр. 43).

ПРИЛОЖЕНИЕ I

РАЗДЕЛ I

Список растений-хозяев Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. упомянутый в ст.

>ТАБЛИЦА>

РАЗДЕЛ II

Опросы

1. Официальные исследования, упомянутые в статье 2(2)(а), должны основываться на биологии организма и конкретных производственных систем в соответствующем государстве-члене и включать:

(i) в случае картофеля,

- в подходящее время визуальный осмотр растущего урожая и/или отбор проб семян и другого картофеля в вегетационный период или на складе. Эти образцы должны быть подвергнуты официальному или официально контролируемому визуальному осмотру путем разрезания клубней, и

- в случае семенного картофеля и, если применимо, для другого картофеля, официальные или официально контролируемые лабораторные испытания с использованием метода, изложенного в Приложении II,

(ii) в случае помидоров,

- визуальный осмотр в подходящее время по крайней мере растущего урожая растений, предназначенных для пересадки для профессионального использования.

2. Уведомление об официальных освидетельствованиях, упомянутых в статье 2(3), должно включать:

(i) в случае обследований картофеля,

- расчетная общая площадь выращивания семенного и прочего картофеля в гектарах,

- стратификация по категориям семян и товарам и, при необходимости, по регионам,

- количество и сроки взятия проб для исследования,

- количество визуальных осмотров на местах,

- количество (и размер выборки) визуальных осмотров клубней;

(ii) в случае обследований, по крайней мере, растущего урожая растений томата, предназначенных для пересадки для профессионального использования,

- предполагаемое общее количество растений,

- количество визуальных осмотров;

(iii) в случае обследований растений-хозяев, кроме картофеля и томатов, включая дикие растения-хозяева пасленовых,

- разновидность,

- количество и время взятия проб,

- территория/река, отбираемая пробы, в зависимости от обстоятельств,

- метод анализа;

(iv) в случае обследований сбросов воды и жидких отходов из помещений промышленной переработки или упаковки,

- количество и сроки отбора проб,

- район/река/расположение помещений, отбираемых для отбора проб, в зависимости от обстоятельств,

- метод анализа.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

ТЕСТ-СХЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ОБЪЕМ СХЕМЫ ИСПЫТАНИЙ

Представленная схема описывает различные процедуры, связанные с:

(i) диагностика бурой гнили клубней картофеля и бактериального увядания растений картофеля и томата;

(ii) обнаружение Ralstonia solanacearum в образцах клубней картофеля;

(iii) идентификация Ralstonia solanacearum.

В приложениях представлена ​​подробная информация о подготовке тестовых материалов, т.е. питательных сред, буферов, растворов, реагентов.

РАЗДЕЛ I

ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ИСПЫТАНИЙ

1. Диагностика бурой гнили клубней картофеля и бактериального увядания растений картофеля и томата.

Методика испытаний предназначена для клубней картофеля с симптомами, типичными или подозрительными на бурую гниль, а также для растений картофеля и томатов с симптомами, типичными или подозрительными на бактериальное увядание. Он предполагает экспресс-тест, выделение возбудителя из инфицированной сосудистой ткани на диагностических средах и в случае положительного результата идентификацию культуры как Ralstonia solanacearum.

Презентация блок-схемы

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

Ссылки на блок-схему:

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

(1) Описание симптомов приведено в разделе II.1.

(2) Экспресс-скрининговые тесты облегчают постановку предварительного диагноза.

Соответствующие тесты:

- Потоковая проба ткани сосудистого ствола (раздел II.2),

- Тест на гранулы поли-ß-гидроксибутирата (раздел II.2),

- тест IF (раздел III.2),

- ИФА-тест (раздел III.3),

- ПЦР-тест (раздел III.4).

(3) Хотя выделение возбудителя из растительного материала с типичными симптомами путем разведения в чашках является простым, культивирование может оказаться неудачным на поздних стадиях инфекции. Сапрофитные бактерии, которые растут на пораженной ткани, могут перерастать или ингибировать патоген в среде выделения. Если тест на изоляцию дает отрицательный результат, но симптомы заболевания типичны, то изоляцию необходимо повторить, предпочтительно с помощью селективного посевного теста.

(4) Надежная идентификация чистой культуры Ralstonia solanacearum достигается с помощью хотя бы одного из тестов, перечисленных в разделе II.4.1, в сочетании с тестом на патогенность (раздел II.4.3). Характеристика штамма не является обязательной, но рекомендуется для каждого нового случая.

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

2. Обнаружение и идентификация Ralstonia solanacearum в образцах клубней картофеля.

Процедура предназначена для выявления латентных инфекций в клубнях картофеля с помощью одного или, предпочтительно, нескольких скрининговых тестов, которые в случае положительного результата дополняются выделением возбудителя; с последующей, в случае выделения типичных колоний, идентификацией чистой культуры как Ralstonia solanacearum.

Презентация блок-схемы

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

Ссылки на блок-схему:

>НАЧАЛО ГРАФИКИ>

(1) Размер выборки

Стандартный размер – 200 клубней. Однако эту процедуру можно удобно применять для образцов с количеством клубней менее 200.

(2) Скрининговые тесты

Одиночный тест может быть недостаточно чувствительным или надежным для обнаружения Ralstonia solanacearum в образце. Поэтому рекомендуется проводить более одного теста, и эти тесты предпочтительно должны быть основаны на разных биологических принципах.

(3) Тест иммунофлуоресценции (ИФ).

Тест IF является хорошо зарекомендовавшим себя скрининговым тестом. Это преимущество перед другими тестами, которые еще не полностью разработаны или проверены. Тест используется для многих других уставных бактерий, например. Clavibacter michiganensis subsp. сепедоник. При заданных в этом методе параметрах считывания это чувствительный тест (порог чувствительности 103-104 клеток на мл гранул картофельного экстракта).

Критическим фактором достоверности результата теста является качество антисыворотки. Приемлема только антисыворотка с высоким титром (минимум 2000 для сырой антисыворотки), и все тесты должны проводиться при титре антисыворотки или на одно разведение ниже титра. Косвенный метод предпочтителен. Прямой метод можно применять, если тест имеет уровень чувствительности и специфичности, эквивалентный уровню непрямого метода.

Преимущество теста IF заключается в субъективной интерпретации морфологии окрашивания клеток и интенсивности флуоресценции, которые предоставляют информацию о специфичности реакции. Перекрестные реакции серологически родственных бактерий из почвы или связанных с тканями картофеля с клеточной морфологией Ralstonia solanacearum являются обычным явлением. Тест IF можно использовать в качестве единственного скринингового теста, хотя в случаях подозрения на перекрестные реакции следует провести дополнительный скрининговый тест, основанный на другом биологическом принципе. В таких случаях выборочное посев является наиболее подходящим испытанием.

(4) Селективное покрытие

С использованием модифицированной среды SMSA и методологии тестирования, указанной в этом методе, это чувствительный и селективный тест на Ralstonia solanacearum. Результат доступен через 3-6 дней после подготовки пробы. Возбудитель получается непосредственно в культуре и может быть легко идентифицирован. Для полного использования своего потенциала тест требует тщательной подготовки пяточных концов, чтобы избежать вторичных бактерий, связанных с клубнем картофеля, которые являются конкурентами Ralstonia solanacearum на среде и могут повлиять на развитие патогена. Некоторые штаммы могут плохо расти, поскольку компоненты среды могут повлиять на целевой организм. Также необходимо соблюдать осторожность, чтобы дифференцировать Ralstonia solanacearum от других бактерий, которые могут развиваться в среде. Селективное высевание может использоваться в качестве единственного скринингового теста при условии, что в случаях, когда подозревается ингибирование Ralstonia solanacearum другими бактериями на чашках и получен отрицательный результат теста, образец проверяется повторно с использованием другого теста для подтверждения или опровержения диагноза. В таких случаях тест IF является наиболее подходящим тестом.

(5) тест ИФА

Тест ELISA, как правило, менее чувствителен, чем тест IF (порог чувствительности 104-105 клеток на мл гранул картофельного экстракта). Тест дешевый и быстрый, но, как правило, более подвержен ложноположительным (перекрестным реакциям) и ложноотрицательным результатам (ингибирование фенольными молекулами в экстракте картофеля). Требования к специфичности антисыворотки чрезвычайно высоки. Тест ELISA не может использоваться в качестве единственного скринингового теста.

(6) ПЦР-тест

ПЦР имеет потенциал для очень чувствительного обнаружения, хотя тест легко ингибируется компонентами экстракта растений или клубней, что приводит к ложноотрицательным результатам. Некоторые сорта картофеля содержат больше ингибиторов, чем другие. Поэтому необходимо удалить эти ингибиторы. Ингибирование можно уменьшить путем разведения, однако популяции Ralstonia solanacearum также разбавляются. На всех этапах подготовки проб и тестов необходимо проявлять особую осторожность, чтобы предотвратить контаминацию, которая может привести к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также возникнуть из-за гомологии последовательностей других организмов. По этим причинам прямая ПЦР не может использоваться в качестве единственного скринингового теста.

(7) Тест на обогащение

Инкубация образцов гранул картофельного экстракта в полуселективном бульоне, таком как модифицированный бульон SMSA, позволяет размножать Ralstonia solanacearum. Возможно, что еще более важно, он также разбавляет потенциальные ингибиторы тестов ELISA или PCR. Таким образом, Ralstonia solanacearum в обогащенном бульоне можно обнаружить методами ИФ, ИФА и ПЦР. Мы не рекомендуем производить прямую закладку из обогащенных бульонов. Эти методы обогащения не были тщательно опробованы и проверены. Они включены сюда, потому что у них хороший потенциал. Однако из-за относительного отсутствия опыта их применения их нельзя использовать в качестве единственных методов обнаружения.

(8) Биоанализ

Биологический анализ используется для выделения Ralstonia solanacearum из гранул картофельного экстракта путем селективного обогащения растения-хозяина и может проводиться на растениях томата или баклажанах. Для проведения теста необходимы оптимальные условия инкубации, указанные в этом методе. Бактерии, ингибирующие Ralstonia solanacearum на среде SMSA, скорее всего, не будут мешать этому тесту.

(9) Подтверждающие тесты

Надежная идентификация чистой культуры Ralstonia solanacearum достигается с помощью хотя бы одного из тестов, перечисленных в разделе II.4.1. в сочетании с тестом на патогенность (раздел II.4.3.). Характеристика штамма не является обязательной, но рекомендуется для каждого нового случая.

>КОНЕЦ ГРАФИКИ>

РАЗДЕЛ II

Диагностика бурой гнили клубней картофеля и бактериального увядания растений картофеля и томата.

1. Симптомы

1.1 Симптомы у картофеля

Картофельный завод. Ранняя стадия заражения – увядание листьев к верхушке растения при высоких температурах в течение дня с восстановлением ночью. Увядание становится быстро необратимым и приводит к гибели растения. Сосудистая ткань в поперечно разрезанных стеблях увядших растений может стать коричневой, а с поверхности среза выделяется молочная слизь или легко выделяется при сдавливании. Если срезанный стебель положить вертикально в воду, из сосудистых пучков потекут нити слизи.

Клубень картофеля. Клубни картофеля необходимо разрезать поперек вблизи пяточного (= столонного) конца. Ранняя стадия инфекции представляет собой изменение цвета сосудистого кольца от стекловидного от желтого до светло-коричневого, из которого через несколько минут спонтанно или при легком надавливании большими пальцами на кожу возле поверхности разреза спонтанно появляется бледно-кремовая слизь. Позже изменение цвета сосудов становится более отчетливым и коричневым, и некроз может распространяться на паренхиматозную ткань. На поздних стадиях инфекция распространяется наружу от пятки и глаз, что может привести к появлению красновато-коричневых, слегка впалых поражений на коже, из которых могут просачиваться бактерии, вызывая прилипание частиц почвы.

1.2 Симптомы у томатов

Томатный завод. Первым видимым симптомом является вялый вид самых молодых листьев. При благоприятных для возбудителя условиях внешней среды (температура почвы около 25 °С, влажность насыщения) в течение нескольких дней наступает эпинастия и увядание одной стороны или всего растения, что приводит к полному гибели растения. В менее благоприятных условиях (температура почвы ниже 21°С) на стебле может развиться большое количество придаточных корней. Вдоль стебля можно наблюдать жирный тяж, свидетельствующий о некрозе сосудистой системы. При поперечном разрезе стебля обесцвеченные коричневые сосудистые ткани стебля выделяют капли белого или желтоватого бактериального сока.

2. Экспресс-скрининговые тесты

Экспресс-скрининговые тесты облегчают постановку предварительного диагноза. Используйте один или несколько из следующих тестов:

Стриминговый тест

Присутствие Ralstonia solanacearum в увядающих стеблях картофеля или томатов можно оценить с помощью следующего простого предположительного теста:

Срежьте стебель чуть выше уровня почвы. Поместите поверхность среза в стакан с водой. Вскоре после этого из сосудистых пучков самопроизвольно вытекают нити бактериальной слизи. Любые другие бактерии, вызывающие сосудистую инфекцию у растений картофеля или томата, не проявляют этого явления.

Обнаружение гранул поли-β-гидроксибутирата (ПГБ)

Гранулы ПОБ в клетках Ralstonia solanacearum визуализируются окраской нильским синим А или суданским черным Б.

Либо подготовьте мазок ила или взвешенной ткани на предметном стекле микроскопа, либо приготовьте мазок 48-часовой культуры на YPGA или SPA (Приложение 1). Подготовьте мазки положительного контроля штамма биовара 2/расы 3 и, если это будет сочтено полезным, мазок отрицательного контроля гетерологичного штамма. Дать высохнуть. Несколько раз быстро проведите нижнюю поверхность предметного стекла через пламя, пока мазок не зафиксируется.

Нильский голубой тест

(1) Залейте фиксированный мазок 1 % водным раствором нильского синего А.

Инкубируйте 10 минут при 55°С.

(2) Слейте красящий раствор. Ненадолго промойте в слегка проточной водопроводной воде. Удалите лишнюю воду салфеткой.

(3) Залейте мазок 8% водным раствором уксусной кислоты.

Инкубируйте в течение одной минуты при температуре окружающей среды.

(4) Промойте в слегка проточной водопроводной воде. Промокните насухо на папиросной бумаге.

(5) Повторно смочите каплей воды. Нанесите покровное стекло.

(6) Осмотрите окрашенный мазок с помощью эпифлуоресцентного микроскопа при длине волны 450 нм в масляной иммерсии и увеличении 1000.

Наблюдайте за ярко-оранжевой флуоресценцией гранул ПГБ. Также наблюдайте при нормальном освещении, чтобы убедиться, что гранулы являются внутриклеточными и что морфология клеток типична для Ralstonia solanacearum.

Суданский черный тест

(1) Залейте фиксированный мазок 0,3 % раствором судана черного Б в 70 % этаноле. Инкубируйте в течение 10 минут при температуре окружающей среды.

(2) Слейте красящий раствор. Ненадолго промойте в водопроводной воде. Удалите лишнюю воду. Удалите лишнюю воду салфеткой.

(3) Ненадолго окуните мазок в ксилол. Промокните насухо на папиросной бумаге.

Осторожность! Ксилол – вредный продукт. Работа в вытяжном шкафу.

(4) Залейте мазок 0,5 % (мас./об.) водным раствором сафранина и оставьте на 10 секунд при температуре окружающей среды.

Осторожность! Сафранин – вредный продукт. Работа в вытяжном шкафу.

(5) Промойте в слегка проточной водопроводной воде. Промокните насухо на папиросной бумаге. Нанесите покровное стекло.

(6) Осмотрите окрашенный мазок с помощью светового микроскопа в проходящем свете под масляной иммерсией при увеличении 1000.

Гранулы ПОБ в клетках Ralstonia solanacearum окрашиваются в сине-черный цвет. Клеточная стенка окрашивается в розовый цвет.

Другие тесты

Другими подходящими скрининговыми тестами являются тест IF (раздел III.2), тест ELISA (раздел III.3) и тест ПЦР (раздел III.4).

3. Процедура изоляции

3.1. Удалите слизь или участки обесцвеченной ткани из сосудистого кольца клубня картофеля или из сосудистых нитей стебля растений картофеля или томата. Приостановить в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды или 50 мМ фосфатного буфера. Оставьте на 5-10 минут на скамейке.

3.2 Приготовьте серию десятичных разведений суспензии, например:

>НОМЕР>1/

>ТО>10

и >NUM>1/

>ТО>100

или более, если это считается целесообразным.

3.3 Перенести стандартный объем суспензии и разведений на обычную питательную среду (NA, YPGA и SPA, Приложение 1) и/или на тетразолиевую среду Кельмана (Приложение 1) и/или на селективную среду SMSA (Приложение 7). ). Распределите или нанесите штрихи с помощью соответствующей техники нанесения разбавления. Если это будет сочтено целесообразным, приготовьте отдельные чашки с каждой используемой средой с разбавленной суспензионной культурой клеток вирулентного штамма биовара 2/расы 3 Ralstonia solanacearum в качестве положительного контроля.

3.4. Инкубируйте чашки в течение трех дней при температуре 28 °C. Инкубация может быть продлена до шести дней, если рост медленный, но колонии на чашках SMSA часто становятся атипичными и отмирают.

На обычных питательных средах вирулентные изоляты Ralstonia solanacearum образуют жемчужно-белые, плоские, неравномерные и текучие колонии, часто с характерными мутовками.

На тетразолиевой среде Кельмана типичные колонии вирулентных изолятов Ralstonia solanacearum имеют кремовую, плоскую, неправильную и текучую форму с кроваво-красными мутовками в центре. Авирулентные формы Ralstonia solanacearum образуют маслянистые темно-красные колонии.

На среде SMSA типичные колонии вирулентных изолятов Ralstonia solanacearum имеют молочно-белый цвет, плоские, неравномерные и текучие с кроваво-красной окраской в ​​центре.

Авирулентные формы Ralstonia solanacearum образуют на среде SMSA менее текучие колонии от розового до красного цвета.

3.5. Очищают колонии характерной морфологии путем пересева на обычную питательную среду. Избегайте регулярного субкультивирования, которое может привести к потере вирулентности.

4. Подтверждающий тест(ы)

4.1 Идентификация Ralstonia solanacearum

Определите чистые культуры Ralstonia solanacearum, используя хотя бы одну из следующих процедур:

Пищевые и ферментативные тесты

Примечание. Включите соответствующие контрольные штаммы в каждый использованный тест.

Следующие фенотипические свойства Ralstonia solanacearum присутствуют или отсутствуют повсеместно:

>ТАБЛИЦА>

Среды и методы представлены в Lelliott & Stead (1987).

IF-тест

Приготовьте суспензию из 106 клеток на мл из культуры и контрольного штамма(ов). Приготовьте серию двукратных разведений антисыворотки. Примените процедуру ЕСЛИ (раздел III.2). Титр IF культуры должен быть эквивалентен титру положительного контроля.

ИФА-тест

Подготовьте суспензию >106 клеток на мл из культуры и контрольного штамма(ов). Примените процедуру ИФА (раздел III.3). Значение ELISA культуры должно быть эквивалентно значению положительного контроля.

ПЦР-тест

Приготовьте суспензию из 106 клеток на мл из культуры и контрольного штамма(ов). Примените процедуру ПЦР (раздел III.4). ПЦР-продукт культуры должен иметь тот же размер и структуру рестриктивного ферментного анализа (REA), что и положительный контроль.

Флуоресцентная гибридизация in-situ (FISH)

Приготовьте суспензию из 106 клеток на мл из культуры и контрольного штамма(ов). Примените процедуру FISH (van Beuningen et al, 1995) с праймером для ПЦР OLI-1 (Seal et al, 1993). Культура должна показать ту же реакцию, что и положительный контроль.

Профилирование белка

Денатурированные цельноклеточные белки разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле - ПААГ (Stead, 1992a).

Профилирование жирных кислот (FAP)

Выращивайте культуру и штамм положительного контроля в течение 48 часов при температуре 28 °C на триптиказо-соевом агаре и применяйте процедуру FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Профиль культуры должен быть идентичен профилю положительного контроля. Характерными жирными кислотами в указанных условиях являются 3ОН 14:0, 2ОН 16:0, 2ОН 16:1 и 2ОН 18:1.

4.2. Характеристика штамма

Определение характеристик штамма не является обязательным, но рекомендуется для каждого нового случая с использованием хотя бы одного из следующих показателей:

Определение Биовара

Ralstonia solanacearum разделяют на биовары на основании способности производить кислоту из трех гексозных спиртов и трех сахаров (Hayward, 1964 & 1994):

>ТАБЛИЦА>

Дополнительные тесты дифференцируют биовар 2 по субфенотипам (Hayward, 1994):

>ТАБЛИЦА>

Определение гонки

Расу (Buddenhagen et al., 1962) можно определить на основе теста на патогенность на растениях томата или баклажана и на растениях табака, а также на основе реакции гиперчувствительности (РЧ) на листьях табака (Lozano и Sequeira, 1970):

>ТАБЛИЦА>

Расовая характеристика с помощью теста на патогенность или теста на гиперчувствительность к табаку может быть не очень надежной и вместо этого может быть сделана на основе биовара и естественного хозяина происхождения.

Культуру можно дополнительно охарактеризовать:

Геномная дактилоскопия

Молекулярная дифференциация штаммов комплекса Ralstoniasolanacearum может осуществляться путем:

ПДРФ-анализ (Кук и др., 1989)

ПЦР с повторяющимися последовательностями [REP-, ERIC- и BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)]

4.3. Тест на патогенность

Этот тест предназначен для подтверждения диагноза Ralstonia solanacearum и для оценки вирулентности культур, идентифицированных как Ralstonia solanacearum.

Подготовьте инокулят из культуры и штамма положительного контроля с концентрацией 106 клеток на мл. Инокулируют 5-10 растений томатов или баклажанов желательно на стадии третьего настоящего листа или старше (раздел III, 6). Инкубируйте до двух недель при температуре 22–28 °C и высокой относительной влажности с ежедневным поливом. Наблюдайте за увяданием и/или эпинастией, хлорозом, задержкой роста.

Изолировать от симптоматических растений следующим образом:

- Удалите часть ткани со стебля на два см выше места прививки.

- Измельчите и суспендируйте в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды или 50 мМ фосфатного буфера. Затем поместите в чашку, инкубируйте и проверьте наличие типичных колоний Ralstonia solanacearum.

РАЗДЕЛ III

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ RALSTONIA SOLANACEARUM В ОБРАЗЦАХ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

Примечание. Стандартный объем выборки составляет 200 клубней. Однако эту процедуру можно удобно применять для образцов с количеством клубней менее 200.

1. Подготовка образца к исследованию

Примечание. Осадок картофельного экстракта, полученный в результате этой процедуры, также можно использовать для обнаружения Clavibacter michiganensis subsp. сепедоник.

Варианты предварительного тестирования, если они считаются полезными:

(i) Инкубируйте образец при температуре 25–30 °C в течение двух недель, чтобы стимулировать размножение популяций с низким содержанием Ralstoniasolanacearum.

(ii) Промойте клубни под проточной водой с использованием соответствующих дезинфицирующих и моющих средств. Высушите клубни на воздухе.

1.1. Чистым и продезинфицированным скальпелем или ножом для овощей снимите кожицу на пяточном конце клубня так, чтобы сначала стали видны сосудистые ткани. Осторожно вырежьте небольшой конический стержень (диаметром 3-5 мм) сосудистой ткани на пяточном конце. Сведите количество несосудистой ткани к минимуму. Обработайте каждый клубень в образце.

Примечание. На этом этапе можно провести визуальный осмотр клубней (раздел II.1). Отложите клубни с симптомами или сильной гнилью и проверьте отдельно (раздел II).

1.2 Соберите пяточные концы в закрытый контейнер. Пяточные концы желательно обрабатывать сразу. Если это невозможно, храните их не более 24 часов или при температуре 4 °C не более 72 часов.

1.3 Обработайте пяточные концы одной из следующих процедур:

(i) Перенесите пяточные концы в подходящий контейнер.

Добавьте достаточный объем буфера для мацерации (Приложение 2), чтобы покрыть пяточные концы.

Измельчите пяточные концы в блендере Waring или Ultra Thurrax до тех пор, пока не будет достигнута полная гомогенизация. Избегайте чрезмерной гомогенизации.

Дайте мацерату впитаться в течение 15–30 минут.

(ii) Перенесите пяточные концы в подходящий контейнер.

Добавьте достаточный объем буфера для мацерации, чтобы покрыть пяточные концы.

Поместите контейнер на ротационный шейкер.

Инкубируйте при 50–100 об/мин в течение 4 часов при 20–22 °C или в течение 16–24 часов при 4 °C.

(iii) Перенесите пяточные концы в прочный одноразовый мешок для мацерации (например, мешок Stomacher размером 105 мм × 150 мм, радиационная стерильность).

Аккуратно раздавите кончики пятки подходящим инструментом, например молотком до достижения полной гомогенизации.

Добавьте достаточный объем буфера для мацерации, чтобы покрыть пяточные концы.

Дайте мацерату отстояться в течение 15–30 минут.

1.4. Извлеките бактерии из обработанных кончиков пяток одной из следующих процедур:

(i) Аккуратно декантируйте мацерат в центрифужную пробирку, оставляя мусор в контейнере или пакете. Если декантированный мацерат мутный, его центрифугируют при ускорении не более 180 g в течение 10 минут при температуре ниже 10 °С.

Центрифугируйте декантированный мацерат или надосадочную жидкость, полученную на первом этапе центрифугирования, при 7000 g в течение 15 минут или при 10 000 g в течение 10 минут при температуре ниже 10 °C.

Выбросьте супернатант, не нарушая осадок.

(ii) Отфильтруйте мацерат через систему фильтрации с размером пор 40–100 мкм. Улучшите фильтрацию с помощью вакуумного насоса.

Соберите фильтрат в центрифужную пробирку.

Промойте фильтр буфером для мацерации.

Фильтрат центрифугируют при 7000 g в течение 15 минут или при 10 000 g в течение 10 минут при температуре ниже 10 °С.

Выбросьте супернатант, не нарушая осадок.

1.5. Ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для пеллет (Приложение 2).

Разделите на две равные части и перенесите каждую часть в микропробирку.

Используйте один микропробирку для тестирования. Оставшуюся часть экстракта сохраняйте при температуре 4 °C во время тестирования.

Добавьте 10–25 % (по объему) стерильного глицерина в другой микропробирку. Вортекс. Хранить при температуре - 18 °C (недели) или при температуре - 70 °C (месяцы).

2. ЕСЛИ-тест

Используйте антисыворотку для Ralstonia solanacearum, предпочтительно для расы 3/биовара 2. Определите титр на суспензии 106 клеток на мл из гомологичного штамма Ralstonia solanacearum с соответствующим разведением конъюгата изотиоцианата флуоресцеина (FITC) в соответствии с рекомендациями производителя. . Сырая антисыворотка должна иметь титр ИФ не менее 1:2000.

Используйте многолуночные предметные стекла желательно с 10 окнами диаметром не менее 6 мм.

Включите контрольный конъюгат FITC на каждое тестовое стекло. Тест следует повторить с включением контроля PBS, если в контроле FITC наблюдаются какие-либо положительные клетки.

Подготовьте отдельные слайды положительного контроля с суспензией 106 клеток на мл из штамма соответствующей расы/биовара Ralstonia solanacearum. Используйте один слайд в каждом наборе тестов.

2.1 Подготовьте тестовые стекла с помощью одной из следующих процедур:

(i) Для гранул с относительно небольшим содержанием крахмала:

Отнесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм — увеличьте объем для окон большего размера) ресуспендированного осадка в ряд окон. Оставшуюся строку можно использовать как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 1.

(ii) Для других гранул:

Приготовьте десятичные разведения, а именно.

>НОМЕР>1/

>ТО>10

,

>НОМЕР>1/

>ТО>100

и >NUM>1/

>ТО>1000

ресуспендированного осадка в буфере для осадка. Отнесите пипеткой отмеренный стандартный объем (15 мкл подходит для окна диаметром 6 мм — увеличьте объем для окон большего размера) ресуспендированного осадка и каждого разведения в ряду окон. Оставшуюся строку можно использовать как дубликат или для второго образца, как показано на рисунке 2.

2.2 Дайте каплям высохнуть. Зафиксируйте бактериальные клетки на предметном стекле нагреванием, пламенем или 95% этанолом.

2.3 Процедура ЕСЛИ

(i) В соответствии с подготовкой предметных стекол в 2.1 (i):

Приготовьте набор двукратных разведений антисыворотки в буфере IF (Приложение 3):

¼ титра (

>ЧИСЛО>Т/

>ТО>4

), ½ титра (

>ЧИСЛО>Т/

>ТО>2

), титр (Т) и удвоенный титр (2Т).

(ii) В соответствии с подготовкой предметных стекол в 2.1 (ii):

Приготовьте рабочее разведение (WD) антисыворотки в буфере IF. Рабочее разведение представляет собой разведение антисыворотки с оптимальной специфичностью и обычно составляет половину титра.

>ТАБЛИЦА>

>ТАБЛИЦА>

2.3.1 Разложите предметные стекла на влажной папиросной бумаге.

Закройте тестовые окна разведением(ями) антисыворотки. Примените PBS на окнах FITC. Объем антисыворотки, нанесенной на окна, должен быть эквивалентен объему нанесенного экстракта.

2.3.2. Инкубировать под крышкой 30 минут при температуре окружающей среды.

2.3.3 Стряхните капли антисыворотки со предметного стекла и тщательно промойте предметные стекла буфером IF. Промывайте в течение пяти минут в буфере IF-Tween, а затем в течение пяти минут в буфере IF (Приложение 3). Тщательно удалите лишнюю влагу.

2.3.4 Разложите предметные стекла на влажной папиросной бумаге. Накройте тестовые окна и окно FITC разведением конъюгата FITC, используемого для определения титра. Объем конъюгата, нанесенного на окна, должен быть идентичен объему нанесенной антисыворотки.

2.3.5. Инкубировать под крышкой 30 минут при температуре окружающей среды.

2.3.6 Стряхните капли конъюгата со предметного стекла. Прополощите и постирайте, как указано выше (2.3.3). Тщательно удалите лишнюю влагу.

2.3.7 Нанесите пипеткой по 5–10 мкл 0,1 М фосфатно-буферного глицерина (Приложение 3) или аналогичного раствора на каждое окно и нанесите покровное стекло.

2.4 Чтение теста ПЧ

Исследуйте предметные стекла на эпифлуоресцентном микроскопе с фильтрами, подходящими для возбуждения ФИТЦ, под масляной иммерсией при увеличении 500-1000. Сканируйте окна по двум диаметрам под прямым углом и по периметру.

Сначала проверьте слайд положительного контроля. Клетки должны быть ярко флуоресцентными и полностью окрашенными. Примечание. Тест необходимо повторить, если окрашивание отклоняется от нормы.

Прочитайте тестовые слайды. Сначала наблюдайте за отсутствием флуоресцирующих клеток в контрольных окнах FITC. Флуоресцирующие клетки в контроле FITC указывают на неспецифическое связывание конъюгата, аутофлуоресценцию или загрязнение: Примечание. Если такое наблюдается, повторите тест.

Наблюдайте за яркими флуоресцирующими клетками с характерной морфологией Ralstonia solanacearum в тестовых окнах. Интенсивность флуоресценции должна быть эквивалентна штамму положительного контроля при том же разведении антисыворотки. Клетки с неполным окрашиванием или со слабой флуоресценцией следует игнорировать, если таких клеток много (см. интерпретацию результата теста IF).

Интерпретация результатов теста IF:

(i) Если яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией не обнаружены, то тест IF отрицательный.

(ii) Если обнаружены яркие флуоресцирующие клетки с характерной морфологией, определите среднее количество клеток в поле зрения микроскопа и рассчитайте количество клеток (N) на мл ресуспендированного осадка (Приложение 4).

Популяция, составляющая примерно 10³ клеток на мл ресуспендированного осадка, считается пределом обнаружения для теста IF.

- для проб с N > 10³ клеток на мл ресуспендированного осадка тест IF считается положительным,

- для проб с N > 10³ клеток на мл ресуспендированного осадка тест ИФ можно считать положительным.

(iii) Если при определении титра антисыворотки обнаруживается большое количество (> 105 клеток на мл) неполных или слабо флуоресцирующих клеток, следует провести второй тест:

- либо тест, основанный на другом биологическом принципе, либо

- повторный тест IF либо со второй антисывороткой, либо с десятикратным разведением осадка.

3. ИФА-тест

На основе Робинсона-Смита и др., 1995 г.

Используйте антисыворотку к Ralstonia solanacearum, предпочтительно к расе 3/биовар 2. Определите титр на суспензии 106 клеток на мл гомологичного штамма Ralstonia solanacearum.

Рекомендуется использовать микротитровальные пластины NUNC-Polysorb.

Включите отрицательный контроль с экстрактом картофеля и контроль с фосфатно-солевым буфером (PBS).

В качестве положительного контроля используйте суспензию > 106 клеток на мл из штамма соответствующей расы/биовара Ralstonia solanacearum. Тестируйте таким же образом, как и образец(ы), но хорошо отделенный от образцов на микротитровальном планшете.

3.1. Отнесите 100–200 мкл ресуспендированного осадка в микропробирку.

Нагревайте в течение 4 минут при температуре 100 °C. Удалить микропробирку на льду.

3.2 Добавьте равный объем карбонатного буфера для покрытия двойной концентрации (Приложение 5). Вортекс.

3.3. Нанесите аликвоты по 100 мкл в каждую из как минимум двух лунок микротитровального планшета. Инкубируйте в течение часа при температуре 37 °С или в течение ночи при температуре 4 °С.

3.4 Вылейте экстракты из лунок. Промойте лунки три раза PBS-Tween (Приложение 5), оставив последний промывной раствор в лунках не менее чем на пять минут.

3.5. Приготовьте соответствующее разведение антисыворотки Ralstonia solanacearum в блокирующем буфере (Приложение 5). Нанесите в лунки по 100 мкл разведения антисыворотки.

Инкубируйте в течение часа при температуре 37°С.

3.6. Вылейте антисыворотку из лунок. Промойте лунки, как указано выше (3.4).

3.7. Подготовьте соответствующее разведение конъюгата щелочной фосфатазы в блокирующем буфере. Внесите в лунки по 100 мкл разведения конъюгата.

Инкубируйте в течение часа при температуре 37°С.

3.8 Вылейте конъюгат из лунок. Промойте лунки, как раньше (3.4 и 3.6).

3.9. Приготовьте раствор субстрата щелочной фосфатазы (приложение 5). Нанесите в лунки по 100 мкл. Инкубируйте от 30 минут до одного часа в темноте при температуре окружающей среды.

3.10. Измерьте поглощение при 409 нм.

Интерпретация теста ИФА:

Тест ELISA является отрицательным, если оптическая плотность (ОП) образца в 2 раза превышает ОП отрицательного контроля.

4. ПЦР-тест

По данным Сила и др., 1993 г.

Примечание. Наконечники для пипеток с фильтром необходимо использовать на всех этапах подготовки проб и других манипуляций, связанных с ПЦР.

Приготовьте суспензию 106 клеток на мл из штамма расы 3/биовара 2 Ralstonia solanacearum в качестве положительного контроля. Испытайте таким же образом, как и образец(ы).

4.1 Пипеткой перенесите 100 мкл ресуспендированного осадка в микропробирку.

Альтернативно, перенесите 90 мкл ресуспендированного осадка в микропробирку, содержащую 10 мкл 0,5 М NaOH. Перемешайте, неоднократно переворачивая микропробирку.

4.2 Нагревайте в течение четырех минут при 100 °С. Немедленно удалите микропробирку на льду.

4.3. Приготовьте не менее двух десятичных разведений, например:

>НОМЕР>1/

>ТО>10

и >NUM>1/

>ТО>100

или более, если это считается полезным, в стерильной дистиллированной или сверхчистой воде (UPW).

4.4. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР (Приложение 6) в стерильном флаконе, добавив в следующем порядке следующие компоненты:

>ТАБЛИЦА>

Дополнительные реакции:

Рассчитайте количество каждого компонента для необходимого количества реакций.

Смешайте компоненты и перенесите 45–48 мкл смеси в стерильные флаконы для ПЦР.

Храните флаконы с реакционной смесью ПЦР на льду.

Для реакционных объемов 25 мкл:

Соответствующим образом уменьшите масштаб компонентов.

4.5 ПЦР-амплификация

4.5.1 Необязательно: Проведите импульсную центрифугирование флаконов с кипяченым образцом и положительным контролем.

Добавьте в указанном порядке во флаконы с реакционной смесью ПЦР по 2–5 мкл образца(ов), водного контроля и положительного контроля. Поместите флаконы в нагревательный блок термоциклера ДНК.

4.5.2 Запустите следующую программу:

1 цикл:

(i) 2 минуты при 96 °C: денатурация матрицы

50 циклов

(ii) 20 секунд при 94 °C: денатурация

(iii) 20 секунд при 68 °C: отжиг праймеров.

(iv) 30 секунд при 72 °C: удлинение копии

1 цикл:

(v) 10 минут при 72 °C: дальнейшее продление

1 цикл:

(vi) хранить при температуре 4 °C

Примечание. Эти параметры относятся к Perkin Elmer 9600. Для других термических циклов может потребоваться нанесение минерального масла на флаконы с ПЦР-реакцией и/или изменение продолжительности этапов (ii), (iii) и (iv) в профиле амплификации.

4.5.3 Выньте флаконы из термоциклера. Анализируйте продукт ПЦР. Если не сделать это немедленно, храните флаконы при температуре 4 °C для использования в тот же день или при -18 °C в течение более длительного времени.

4.6 Анализ продукта ПЦР

ПЦР-фрагменты выявляют электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием бромидом этидия.

4.6.1. Приготовьте подходящий агарозный гель, осторожно доведя до кипения агарозу в трис-ацетат-электрофорезном (ТАЕ) буфере.

4.6.2 Охладить расплавленную агарозу до 50-60 °С, вылить в форму электрофорезной установки и вставить гребенку. Дайте раствору затвердеть.

4.6.3 Снимите гребенку. Погрузите гель в ТАЕ так, чтобы он был покрыт (2-3 мм) буфером.

4.6.4. Поместите капли загрузочного буфера объемом 3 мкл на парафильм. Добавьте 12 мкл продукта ПЦР из образцов, положительного контроля или водного контроля и перемешайте осторожной аспирацией в кончике пипетки перед загрузкой. Данные объемы могут быть изменены в соответствии с емкостью лунок агарозного геля.

4.6.5 Осторожно загрузите в лунки гель. Включите для справки соответствующий ДНК-маркер хотя бы в одну лунку.

4.6.6 Соединить провода источника питания и оборудования для электрофореза. Пропускайте гель при напряжении 5–8 В/см до тех пор, пока передняя часть индикатора отслеживания не окажется в пределах 1 см от конца геля.

4.6.7 Выключите электропитание. Отсоедините провода от блока электрофореза.

Аккуратно удалите гель. Замочите его в растворе бромистого этидия на 30-45 минут.

Примечание. При работе с бромистым этидием, который является мощным мутагеном, всегда надевайте одноразовые перчатки!

4.6.8 Окрасить в дистиллированной воде в течение 10-15 минут.

4.6.9 Визуализируйте амплифицированный фрагмент(ы) ДНК с помощью УФ-трансиллюминации. Продукт ПЦР Ralstonia solanacearum с набором праймеров OLI-1 и Y-2 имеет длину 288 п.о. Проверьте наличие маркера ДНК и положительного контроля.

Примечание. Контроль воды в каждом случае должен быть отрицательным. В случае положительного результата повторите тест.

4.6.10 Сфотографируйте гель, если требуется постоянная запись.

4.6.11. Подтвердить подлинность амплифицированного фрагмента с помощью анализа ферментов рестрикции (REA).

4.7 Анализ ферментов рестрикции (REA)

4.7.1. Переносят 8,5 мкл продукта ПЦР (4.5.3) в новый микропробирку. Добавьте 1 мкл 10 × ферментного буфера и 0,5 мкл фермента рестрикции Ava II.

4.7.2. Смешайте осторожной аспирацией кончиком пипетки. Если капли остались на стенках флакона, импульсно центрифугируют. Инкубируйте в течение часа при температуре 37°С.

4.7.3 Анализируют расщепленный ПЦР-фрагмент электрофорезом в агарозном геле, как описано выше (4.6).

Интерпретация результата ПЦР-теста:

ПЦР-тест является отрицательным, если характерный фрагмент размером 288 п.о. не обнаружен и фрагмент обнаружен для штамма положительного контроля Ralstonia solanacearum.

ПЦР-тест является положительным, если обнаружен фрагмент длиной 288 п.о. и REA-анализ амплифицированного фрагмента идентичен штамму положительного контроля Ralstonia solanacearum.

5. Тест выборочного покрытия

На основе Elphinstone et al., 1996 г.

5.1 Выполните испытание, используя соответствующую технику посева для разбавления, например:

(i) Приготовьте как минимум два десятичных разведения, а именно.

>НОМЕР>1/

>ТО>10

и >NUM>1/

>ТО>100

или более, если это считается полезным, ресуспендированного осадка в буфере для осадок. Отмеренный стандартный объем (50–100 мкл) ресуспендированного осадка и каждого разведения внесите пипеткой в ​​модифицированную селективную среду SMSA (Приложение 7) и распределите стеклянной палочкой по всей поверхности среды.

Если это будет сочтено целесообразным, также выполните серию разбавлений ресуспендированного осадка петлей объемом 10 мкл. Подожгите петлю между полосами.

(ii) Перенесите отмеренный стандартный объем (50–100 мкл) ресуспендированного осадка на модифицированную селективную среду SMSA и распределите стеклянной палочкой по всей поверхности среды. Нанесите стержень, не допуская возгорания, как минимум на две другие модифицированные пластины SMSA.

5.2. Применяют тем же методом разведения суспензию 106 клеток на мл из вирулентного штамма расы 3/биовара 2 Ralstonia solanacearum в качестве положительного контроля на набор отдельных модифицированных чашек SMSA.

5.3. Инкубируйте чашки при температуре 28 °C. Начинайте читать таблички через три дня. Если результат отрицательный, инкубируйте дальше до шести дней. Колонии вирулентных изолятов Ralstonia solanacearum молочно-белые, плоские, неправильной формы, текучие, с кроваво-красной окраской в ​​центре и с внутренними полосками или мутовками.

5.4. Очищают колонии характерной морфологии путем пересева на обычную питательную среду (приложение 1).

5.5 Идентифицировать чистые культуры (раздел II, 4.1) и подтвердить культуры Ralstonia solanacearum с помощью теста на патогенность (раздел II, 4.3).

Интерпретация результатов испытания селективного покрытия:

Селективная посевная проба является отрицательной, если через шесть дней не выделено ни одной бактериальной колонии или если не выделено ни одной колонии, характерной для Ralstonia solanacearum, при условии, что не подозревается ингибирование со стороны колоний других бактерий и что в положительном контроле обнаружены колонии, характерные для Ralstonia solanacearum. .

Селективная посевная проба считается положительной, если изолированы колонии, характерные для Ralstonia solanacearum.

6. Биоанализ

По материалам Янсе, 1988 год.

6.1 Для каждого образца используют 10 тестовых растений восприимчивых сеянцев томатов или баклажанов на стадии третьего настоящего листа. Не поливайте тест-растения за 24 часа до инокуляции.

6.2 Распределите 100 мкл ресуспендированного осадка между испытательными растениями. Инокулируют стебель между семядолями и в одном или нескольких других местах.

6.3 Инокулируют по той же методике 10 сеянцев суспензией 106 клеток на мл из вирулентного штамма Ralstonia solanacearum биовара 2/расы 3 в качестве положительного контроля и пеллетбуфера в качестве отрицательного контроля. Отделите растения положительного контроля от других растений, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

6.4. Выращивайте тестовые растения в течение четырех недель при температуре 22–28 °C и высокой относительной влажности с ежедневным поливом. Наблюдайте за увяданием, эпинастией, хлорозом и/или задержкой роста.

6.5. Изолировать от зараженных растений (раздел II). Идентифицировать чистые культуры с характерной морфологией (раздел II.4.1) и подтвердить культуры Ralstonia solanacearum с помощью теста на патогенность (раздел II.4.3).

6.6 Если это считается целесообразным, проверьте отсутствие инфекции в партиях тестовых растений, не имеющих никаких признаков инфекции. Удалите из каждого тестируемого растения участок стебля длиной один см на расстоянии двух см над точкой инокуляции. Гомогенизировать ткани в буфере для мацерации. Выполните посев разбавления (раздел III.5.1). В случае положительного результата идентифицируйте чистые культуры с характерной морфологией (раздел II.4.1) и подтвердите культуры Ralstonia solanacearum с помощью теста на патогенность (раздел II.4.3).

Интерпретация результатов биоанализа:

Биологический тест является отрицательным, если тестируемые растения не заражены Ralstonia solanacearum и при условии, что Ralstonia solanacearum обнаружена в положительном контроле.

Биоанализ дает положительный результат, если тестируемые растения заражены Ralstonia solanacearum.

7. Тесты по обогащению

На основе Elphinstone et al., 1996 г.

7.1. Перенесите 100 мкл ресуспендированного осадка в три мл модифицированного бульона SMSA (Приложение 7).

7.2 Инкубируйте в течение 48 часов, но в любом случае не более 72 часов, при температуре 28 °C со свободно закрытой крышкой пробирки для аэрации.

7.3 Затяните крышку и перемешайте. Аликвоты для теста IF (этот раздел, 2.), теста ELISA (этот раздел, 3.) и/или теста ПЦР (этот раздел, 4.).

8. Тест на патогенность

См. раздел II.4.3.

Приложение 1

Питательные среды для выделения и культивирования Ralstonia solanacearum

Питательный агар (NA)

>ТАБЛИЦА>

Приготовьте ½-литровые объемы среды в литровых колбах.

Растворите ингредиенты.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Остудить до 50°С. Налейте тарелки.

Дрожжево-пептонно-глюкозный агар (ЙОГА)

>ТАБЛИЦА>

Приготовьте ½-литровые объемы среды в литровых колбах.

Растворите ингредиенты.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Остудить до 50°С. Налейте тарелки.

Сахарозно-пептонный агар (SPA)

>ТАБЛИЦА>

Приготовьте ½-литровые объемы среды в литровых колбах.

Растворите ингредиенты. При необходимости доведите pH до 7,2-7,4.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Остудить до 50°С. Налейте тарелки.

Тетразолиевая среда Кельмана

>ТАБЛИЦА>

Приготовьте ½-литровые объемы среды в литровых колбах.

Растворите ингредиенты. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Остудить до 50°С.

Добавьте стерилизованный фильтрованием водный раствор хлорида трифенилтетразолия (Sigma) до получения конечной концентрации 50 мг на литр.

Налейте тарелки.

Приложение 2

Материалы для подготовки проб

Буфер для мацерации: 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,0.

Этот буфер используется для мацерации тканей.

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты и проверьте pH. Аликвоты, если это считается целесообразным.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Добавление 5% поливинилпирролидона-40000 MWT (ПВП-40) рекомендуется при проведении прямого ПЦР-теста, чтобы снизить вероятность ингибирования амплификации ароматическими молекулами в экстракте.

Для мацерации сердцевины тканей картофеля рекомендуется добавлять дефлокулянт, пеногаситель или антиоксидант, используя процедуру гомогенизации Waring Blender или Ultra Turrax.

>ТАБЛИЦА>

Автоклав отдельно. Добавьте до желаемой концентрации.

Пеллетный буфер: 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,2.

Этот буфер используется для ресуспендирования и разведения картофельных пятен и гранул.

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты и проверьте pH. Аликвоты, если это считается целесообразным.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Приложение 3

Материалы для теста ПЧ

IF-буфер: 10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2.

Этот буфер используется для разведения антисыворотки.

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты и проверьте pH. Аликвоты, если это считается целесообразным.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

IF-буфер-Tween

Этот буфер используется для промывания предметных стекол. Добавьте 0,1% Tween 20 в буфер IF.

0,1 М глицерин с фосфатным буфером pH 7,6

Этот буфер используется в качестве жидкости для крепления на окнах предметного стекла IF для усиления флуоресценции.

>ТАБЛИЦА>

Приложение 4

Определение уровня загрязнения в тесте IF

Площадь поверхности (S) окна многоточечного слайда

= >ЧИСЛО>ð D2

>ТО>4

>ТАБЛИЦА>

(1) Площадь поверхности объективного поля

= >ЧИСЛО>ð d2

>ТО>4

>ТАБЛИЦА>

(2) Рассчитайте d либо прямым измерением, либо по следующей формуле:

s = >NUM>ð i2

>THE>G2 K2 × 4

(3)

>ТАБЛИЦА>

из (2)

d = &радик;

>NUM>4 с

>день>д

(4)

из (3)

d = &радик;

>ЧИСЛО>4 × >ЧИСЛО>ð i2

>THE>G2 K2 × 4

>день>д

= >ЧИСЛО>я

>THE>ГК

Подсчитайте количество типичных флуоресцентных клеток в поле (с).

Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на окно (С).

С = с >ЧИСЛО>S

>ТО>п

Рассчитайте количество типичных флуоресцентных клеток на мл осадка (N)

N = C × >NUM>1 000

>DEN>y

× Ф

>ТАБЛИЦА>

Приложение 5

Материалы для теста ИФА

Карбонатный покрывающий буфер двойной силы, pH 9,6

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты и проверьте pH. Аликвоты, если это считается целесообразным.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Сульфит натрия в конечной концентрации 0,2% может быть добавлен в качестве антиоксиданта, если экстракт содержит высокую долю ароматических молекул.

10 × фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты и проверьте pH. Аликвоты, если это считается целесообразным.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Фосфатно-солевой буферный раствор-твин (PBS-T)

>ТАБЛИЦА>

Блокирующий буфер (антитела) (должен быть свежеприготовленным)

>ТАБЛИЦА>

Раствор субстрата щелочной фосфатазы pH 9,8

>ТАБЛИЦА>

Перемешайте и доведите pH до 9,8 с помощью концентрированной HCl.

Доведите до одного литра дистиллированной водой.

Добавьте 0,2 г MgCl2.

Две таблетки субстрата фосфатазы по 5 мг (Sigma) растворяют в 15 мл раствора.

Приложение 6

Материалы для ПЦР-теста

Последовательность олигонуклеотидного праймера

>ТАБЛИЦА>

Материалы см. в Seal et al (1993).

Приложение 7

Материалы для испытаний на селективное гальванопокрытие и обогащение

SMSA Селективная среда (Engelbrecht, 1994 в модификации Elphinstone et al, 1996), но удаляют агар и соли тетразолия.

Базальная среда

>ТАБЛИЦА>

Подготовить >NUM>1/

>ТО>2

литровые объемы среды в литровых колбах.

Растворите ингредиенты и проверьте pH. При необходимости доведите pH до 6,5 перед автоклавированием. Ralstonia solanacearum плохо растет на среде с pH > 7,0.

Стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут.

Остудить до 50°С.

Добавьте следующие ингредиенты (все от Sigma) для получения указанной конечной концентрации:

>ТАБЛИЦА>

Растворите ингредиенты в 70 % этаноле до концентрации, соответствующей объему приготовленной среды. Некоторые ингредиенты, а именно. полимиксин B и хлорамфеникол требуют легкого нагревания и встряхивания.

Бульон SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Приготовьте как селективную среду SMSA, но удалите агар.

Разлить аликвотами по три мл в одноразовые универсальные пробирки емкостью 30 мл.

Рекомендации

Будденхаген, И.В.; Секейра Л. и Кельман А. 1962. Описание рас Pseudomonas solanacearum. Фитопатология 52, 726.

Кук, Д.; Элизабет Б. и Секейра Л., 1989. Генетическое разнообразие Pseudomonas solanacearum: обнаружение полиморфизма длины рестрикционных фрагментов с помощью ДНК-зондов, определяющих вирулентность и реакции гиперчувствительности. Молекулярные взаимодействия растений и микробов 2, 113–121.

Динесен И.Г. и ДеБоер, С.Х. 1995. Экстракция Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus из составных образцов клубней картофеля. Американский картофельный журнал 72, 133–142.

Эльфинстон, Дж.Г.; Хеннесси, Дж.; Уилсон Дж. и Стед Д.Э. 1996. Чувствительность различных методов обнаружения Pseudomonas solanacearum (Смит) Смит в экстрактах клубней картофеля. Бюллетень ЕОКЗР 26.

Энгельбрехт, М.К. 1994. Модификация полуселективной среды для выделения и количественного определения Pseudomonas solanacearum. Информационный бюллетень ACIAR о бактериальном увядании 10, 3-5.

Хейворд, AC 1964. Характеристики Pseudomonas solanacearum. Журнал прикладной бактериологии 27, 265–277.

Хейворд, AC 1994. Систематика и филогения Pseudomonas solanacearum и родственных бактерий. В: Бактериальное увядание: болезнь и ее возбудитель, Pseudomonas solanacearum (под ред. AC Hayward и GL Hartman) CAB International Oxford, 127-135.

Янсе, JD 1988. Метод обнаружения Pseudomonas solanacearum в бессимптомных клубнях картофеля и некоторые данные о его чувствительности и специфичности. Бюллетень ЕОКЗР 18, 343-351.

Янсе, Дж. Д. 1991. Инфра- и внутривидовая классификация штаммов Pseudomonas solanacearum с использованием анализа жирных кислот цельных клеток. Систематическая и прикладная микробиология 14, 335–345.

Кельман, А. 1954. Связь патогенности Pseudomonas solanacearum с появлением колоний на тетразолиевой среде. Фитопатология 64, 293-695.

Леллиот, Р.А. и Стед, Д.Э., 1987. Методы диагностики бактериальных болезней растений. (ред. Т.Ф. Приса) Blackwell Scientific Publications, Оксфорд. 216 стр.

Лоус, Ф.Дж.; Фулбрайт, Д.В.; Стивенс, Коннектикут и Де Брёйн, Ф.Дж., 1995. Дифференциация геномной структуры с помощью повторной ПЦР-дактилоскопии для быстрой классификации Xanthomonas Campestris pv. везикатория. Фитопатология 85, 528-536.

Лозано Дж. К. и Секейра Л., 1970. Дифференциация рас Pseudomonas solanacearum методом инфильтрации листьев. Фитопатология 60, 838.

Мирза, М.С.; Радемейкер, JWL; Янсе, Дж. Д. и Аккерманс, ADL, 1993, Специфический олигонуклеотидный зонд, нацеленный на 16S рибосомальную РНК, против Clavibacter michiganensis subsp. сепедоник. Канадский журнал микробиологии 39, 1029–1034.

Робинсон-Смит, А.; Джонс, П.; Эльфинстон, Дж.Г. и Форде, S.M.D., 1995. Производство антител к Pseudomonas solanacearum, возбудителю бактериального увядания. Пищевая и сельскохозяйственная иммунология 7, 67-79.

Сил, SE; Джексон, Лос-Анджелес; Янг, J.P.W. и Дэниелс, М.Дж., 1993. Дифференциация Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. Picketti и бактерий, вызывающих заболевания крови, путем частичного секвенирования 16S рРНК: создание олигонуклеотидных праймеров для чувствительного обнаружения с помощью полимеразной цепной реакции. Журнал общей микробиологии 139, 1587–1594.

Смит, Джей-Джей; Оффорд, Лос-Анджелес; Холдернесс М. и Сэддлер Г.С., 1995. Генетическое разнообразие расы 3 Burkholderia solanacearum (синоним Pseudomonas solanacearum) в Кении. Прикладная и экологическая микробиология 61, 4262-4268.

Стед, Д.Э., 1992а. Методы обнаружения и идентификации фитопатогенных бактерий. В: Методы быстрого обнаружения патогенов растений (под ред. Дж. М. Дункана и Л. Торранса). Научные публикации Блэквелла, Оксфорд, 76–111.

Стед, Д.Э., 1992b. Группировка фитопатогенов и некоторых других видов Pseudomonas. с использованием профилей клеточных жирных кислот. Международный журнал систематической бактериологии 42, 281–295.

Ван Бёнинген, А.; Деркс Х. и Янсе Дж.Д., 1995. Обнаружение и идентификация Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, уделив особое внимание флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH) с использованием олигонуклеотидного зонда, нацеленного на 16S рРНК. Цюхтунгсфоршунг 2, 266–269.

ПРИЛОЖЕНИЕ III

1. Для каждого подозрительного случая, для которого был выявлен положительный результат скринингового теста(ов) в соответствии с внесенным в список растительным материалом соответствующим методом, изложенным в Приложении II, или, во всех других случаях, любым другим официально утвержденным методом. и ожидается подтверждение или опровержение путем завершения указанного метода, должно быть сохранено и соответствующее сохранение:

- по возможности, партия или ее часть (от которой была взята проба) в оригинальной упаковке с этикеткой,

- по возможности оставшуюся часть образцов,

- любой оставшийся экстракт и дополнительно подготовленный материал для скринингового теста(ов), например. иммунофлуоресцентные слайды и,

- вся необходимая документация,

до завершения указанного метода.

2. В случае подтверждения организма необходимо обеспечить сохранение и соответствующую консервацию:

- материал, указанный в пункте 1, и

- образец зараженного материала томатов или баклажанов, инокулированный экстрактом клубня или растения, где это применимо, и

- изолированная культура организма,

в течение как минимум одного месяца после процедуры уведомления в соответствии со статьей 5(2).

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

Элементы расследования, упомянутые в статье 5(1)(a)(i), должны включать, где это уместно:

(i) места производства,

- выращивание или выращивание картофеля, клонально родственного картофелю, у которого обнаружено заражение этим организмом,

- выращивание или выращивание томатов, происходящих из того же источника, что и томаты, у которых обнаружено заражение этим организмом,

- выращивание или выращивание картофеля или томатов, которые были помещены под официальный контроль из-за подозрения на появление организма,

- выращивание или выращивание картофеля, клонально родственного картофелю, выращенному на местах производства, зараженных данным организмом,

- выращивающие картофель или томаты и расположенные по соседству с зараженными местами производства, в том числе с такими местами производства, совместно использующими производственное оборудование и мощности напрямую или через общего подрядчика,

- использование поверхностных вод для орошения или опрыскивания из любого источника, подтвержденного или предположительно зараженного этим организмом,

- использование поверхностных вод для орошения или опрыскивания из источника, используемого совместно с местами производства, где подтверждено или предположительно заражение данным организмом,

- затоплены или были затоплены поверхностными водами, зараженными данным организмом или предположительно зараженными; и,

(ii) поверхностные воды, используемые для орошения или опрыскивания или затопившие поля или места производства, подтвержденные как зараженные этим организмом.

ПРИЛОЖЕНИЕ V

1. Элементы определения степени вероятного загрязнения в соответствии со статьей 5(1)(a)(iii) и 5(1)(c)(iii) должны включать, где это уместно:

- внесенный в список растительный материал, выращенный на месте производства, обозначенном как загрязненный в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii),

- места производства, имеющие производственную связь с включенным в список растительным материалом, обозначенным как загрязненные в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii), включая те, которые совместно используют производственное оборудование и помещения напрямую или через общего подрядчика,

- списочный растительный материал, произведенный в месте(ах) производства, указанном в предыдущем абзаце, или присутствующий в таком месте(ах) производства в течение периода, когда списочный растительный материал был признан загрязненным в соответствии со статьей 5(1)(а) )(ii) присутствовал на местах производства, указанных в первом абзаце,

- магазины, осуществляющие обращение с перечисленным растительным материалом из вышеуказанных мест производства,

- любое оборудование, транспортное средство, сосуд, склад или его части, а также любые другие объекты, включая упаковочный материал, которые могли вступить в контакт с включенным в список растительным материалом, обозначенным как загрязненный в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii),

- любой из перечисленных растительных материалов, хранящихся в любых конструкциях или объектах, перечисленных в предыдущем абзаце, или находящихся в контакте с ними, до очистки и дезинфекции таких структур и объектов,

- в результате исследования и испытаний в соответствии со Статьей 5(1)(a)(i) в случае картофеля - те клубни или растения, имеющие сестринское или родительское клональное родство, а в случае томата - эти растения из того же источника, что и перечисленный растительный материал, признанный загрязненным в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii), и для которого, хотя они и могли иметь отрицательный результат на данный организм, представляется, что контаминация вероятна через клональную связь ,

- место(а) производства перечисленного растительного материала, указанного в предыдущем абзаце,

- место(а) производства перечисленного растительного материала с использованием воды для орошения или опрыскивания, которое было определено как загрязненное согласно Статье 5(1)(c)(ii),

- перечисленный растительный материал, произведенный на полях, затопленных поверхностными водами, зараженный данным организмом.

2. Определение возможного распространения в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv) и 5(1)(c)(iii) должно включать:

(i) в случаях, предусмотренных статьей 5(1)(a)(iv), рассмотрение следующих элементов:

- близость других мест производства, выращивающих указанный растительный материал,

- совместное производство и использование запасов семенного картофеля,

- места производства, использующие поверхностные воды для орошения или опрыскивания перечисленного растительного материала в случаях, когда существует или существовал риск стока поверхностных вод или затопления места(ов) производства, обозначенного как загрязненное в соответствии со Статьей 5( 1)(а)(ii);

(ii) в случаях, когда поверхностные воды были определены как загрязненные согласно Статье 5(1)(c)(ii):

- места производства, производящие внесенный в список растительный материал, прилегающие к поверхностным водам, обозначенным как загрязненные, или подверженные риску затопления,

- любой отдельный оросительный бассейн, связанный с поверхностными водами, обозначенными как загрязненные.

3. Подробности уведомления, упомянутого в первом подпараграфе статьи 5(2), должны включать:

- дата сообщения о подозрении на возникновение согласно Статье 4 и даты отбора проб и подтверждения присутствия организма согласно Статье 5, в зависимости от обстоятельств,

- описание элементов обозначенного загрязнения и разграничение зон.

4. Подробности дополнительного уведомления, упомянутого во втором подпункте статьи 5(2), должны включать:

- для любой партии или партии картофеля, обозначенной как загрязненная, сертификаты, предусмотренные статьями 7 и 8 Директивы 77/93/ЕЭС, номер паспорта или регистрационный номер производителей картофеля, коллективных складов и центров отправки, в зависимости от обстоятельств,

- для любой партии или партии растений томата, обозначенных как зараженные, сертификаты, предусмотренные статьями 7 или 8 Директивы 77/93/ЕЕС, и номер паспорта в соответствии со списком в Приложении V, Часть А, Раздел I.2.2 к Директиве 77/. 93/ЕЕС,

- название сорта и категорию для подвоев семенного картофеля и, где это возможно, во всех других случаях,

- такую ​​другую информацию, касающуюся подтвержденной вспышки, которую может потребовать Комиссия.

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

1. Что касается статьи 6(1), то положения должны быть следующими:

- сжигание или

- использовать в качестве корма для животных после термической обработки таким образом, чтобы не было риска выживания организма, или

- глубокое захоронение на свалке, где нет риска просачивания на сельскохозяйственные земли или контакта с источниками воды, которые могут быть использованы для орошения сельскохозяйственных земель, или

- промышленная переработка посредством прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с официально утвержденными объектами по удалению отходов, которые соответствуют положениям, изложенным в Приложении VII к настоящей Директиве, или

- другие меры, если установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; такие меры должны быть немедленно доведены до сведения Комиссии и других государств-членов.

2. Надлежащее использование или утилизация внесенного в список растительного материала, указанного в Статье 6(2), под контролем ответственных официальных органов соответствующего(их) государства(ов)-члена(ов) с соответствующей связью между ответственными официальными органами для обеспечения такого контроля при все сроки и одобрение ответственного официального органа государства-члена, где картофель должен быть упакован или переработан в отношении объектов по удалению отходов, указанных в первом и втором абзацах, должны быть:

(i) для клубней картофеля,

- использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для потребления и упакованного на площадках с соответствующими средствами утилизации отходов, готового к непосредственной доставке и использованию без переупаковки и предназначенного для такой непосредственной доставки и использования, или

- использовать в качестве продовольственного картофеля, предназначенного для промышленной переработки и предназначенного для прямой и немедленной доставки на перерабатывающий завод с соответствующими сооружениями для удаления отходов, или

- какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма и одобрено указанными ответственными официальными органами. О таких мерах необходимо немедленно уведомить Комиссию и другие государства-члены.

(ii) для других частей растений, включая остатки стеблей и листвы,

- разрушение или

- какое-либо другое использование или утилизация при условии, что установлено отсутствие идентифицируемого риска распространения организма; о таких мерах должно быть доведено до сведения Комиссии и других государств-членов.

3. Соответствующими методами обеззараживания объектов, указанных в статье 6(3), должны быть очистка и, при необходимости, дезинфекция, исключающие идентифицируемый риск распространения организма, и они должны применяться под наблюдением ответственного должностного лица. органы государств-членов.

4. Серия мер, которые должны быть реализованы государствами-членами в демаркированной зоне(ах), установленной в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv) и (c)(iii) и указанной в статье 6(4), должна включать :

4.1. В случаях, когда места производства были признаны загрязненными в соответствии со статьей 5(1)(a)(ii):

(a) на поле или в единице выращивания защищенных сельскохозяйственных культур, обозначенных как загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii), либо

(i) в течение как минимум четырех вегетационных лет после указанного загрязнения,

- должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томата, а также других растений-хозяев организма, в том числе пасленовых сорняков, и

- нельзя сажать:

- клубни или растения картофеля,

- растения и семена томатов,

- с учетом биологии организма,

- другие растения-хозяева,

- растения видов Brassica, для которых установлен риск выживания организма,

- культуры, для которых установлен риск распространения микроорганизма;

- в первый сезон выращивания картофеля или томатов, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце, и при условии, что поле было признано свободным от самостоятельных растений картофеля, томата и других растений-хозяев, включая пасленовые сорняки, по крайней мере, в течение двух последовательных лет выращивания. перед посадкой,

- в случае картофеля официально сертифицированный семенной картофель должен высаживаться только для производства продовольственных товаров и,

- должно быть проведено официальное обследование, включая тестирование, как подробно описано в Статье 2(1),

- в сезон сбора урожая картофеля или томатов, следующий за сезоном, указанным в предыдущем абзаце, и после соответствующего цикла севооборота, в случае картофеля официально сертифицированный семенной картофель должен быть высажен либо для производства семян, либо для производства продовольственных товаров, а в случае картофеля и томатов - должно быть проведено официальное обследование, как указано в Статье 2(1); или

(ii) в течение пяти лет выращивания, следующих за годом указанного загрязнения,

- должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томата, а также других растений-хозяев организма, в том числе пасленовых сорняков, и

- поле должно быть заложено и поддерживаться в течение первых трех лет либо под чистым паром, либо под зерновыми в зависимости от выявленного риска, либо на постоянном пастбище с частыми скосами или интенсивным выпасом, либо в качестве травы для производства семян, с последующим посадка в последующие два года растений, не являющихся хозяевами данного организма, для которых не выявлен риск выживания или распространения организма,

- в первый сезон выращивания картофеля или томатов, следующий за периодом, указанным в предыдущем абзаце,

- в случае картофеля необходимо высаживать официально сертифицированный семенной картофель для производства семян или продовольственных товаров,

и должно быть проведено официальное обследование, включая тестирование, как подробно описано в Статье 2(1);

(б) в других областях:

- в год вегетации, следующий за указанным загрязнением:

- либо клубни картофеля, либо растения, либо другие растения-хозяева организма не высаживаются, и должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томатов, а также других растений-хозяев, включая пасленовые сорняки, в зависимости от обстоятельств, или

- в случае клубней картофеля официально сертифицированный семенной картофель может быть высажен только для производства продовольственных товаров, при условии, что ответственные официальные органы удостоверятся в том, что риски для растений-добровольцев картофеля и томатов и других растений-хозяев организма, включая пасленовые сорняки, были устранены. Растущая культура должна быть проверена в соответствующее время, а растения картофеля-добровольца должны быть проверены на наличие этого микроорганизма; кроме того, у картофеля необходимо осмотреть собранные клубни;

- за первый год выращивания, следующий за указанным в первом абзаце,

- в случае картофеля для производства семян или продовольственных товаров следует сажать только официально сертифицированный семенной картофель,

- по крайней мере, в течение второго года выращивания, следующего за годом, указанным в первом абзаце,

- в случае картофеля для производства семян или продовольственных товаров следует сажать только официально сертифицированный семенной картофель или семенной картофель, выращенный под официальным контролем из официально сертифицированного семенного картофеля,

- в каждый год выращивания, указанный в предыдущих абзацах, должны быть приняты меры по уничтожению самостоятельных растений картофеля и томатов, а также других растений-хозяев организма, включая пасленовые сорняки, и должно быть проведено официальное обследование, как подробно описано в Статье 2 (1). проводятся, а в случаях посадки семенного картофеля на семеноводство испытания клубней;

(c) сразу после определения загрязнения в соответствии со Статьей 5(1)(a)(ii) и в каждый из последующих лет выращивания до и включая первый разрешенный сезон выращивания картофеля или томатов на поле(ях), обозначенном как загрязненное , как подробно описано в пункте (a):

- все оборудование и складские помещения на месте производства, задействованные в производстве картофеля или томатов, должны быть очищены и, при необходимости, продезинфицированы с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3,

- официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая их запрет, должен быть введен в случае необходимости, чтобы предотвратить распространение организма;

(d) в единице производства защищенных сельскохозяйственных культур, обозначенной как загрязненная согласно Статье 5(1)(a)(ii), где возможна полная замена питательной среды,

- никакие клубни или растения картофеля или другие растения-хозяева данного организма, включая растения и семена томата, не должны высаживаться, если только указанная единица не была подвергнута официально контролируемым мерам по уничтожению организма и удалению всего растительного материала-хозяина, включая, по крайней мере, полная замена питательной среды, а также очистка и, при необходимости, дезинфекция указанного агрегата и всего оборудования, и впоследствии было получено разрешение на производство картофеля или томатов от ответственных официальных органов, и

- при производстве картофеля эта продукция должна производиться из официально сертифицированного семенного картофеля или из мини-клубней или микрорастений, полученных из проверенных источников,

- Официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая их запрет, должен быть введен в случае необходимости, чтобы предотвратить распространение организма.

4.2. В пределах демаркированной зоны, без ущерба для мер, подробно описанных в пункте 4.1, государства-члены должны:

(a) немедленно и в течение как минимум трех лет выращивания после указанного загрязнения:

(aa) в случаях, когда демаркированная зона была определена в соответствии со статьей 5(1)(a)(iv),

- обеспечивать надзор со стороны ответственных должностных лиц за помещениями, где выращивают, хранят или обращаются с клубнями картофеля или томатов, а также за помещениями, в которых эксплуатируется техника для производства картофеля или томатов по договору,

- требовать очистки и, при необходимости, дезинфекции оборудования и складов в таких помещениях с использованием соответствующих методов, как указано в пункте 3,

- требовать посадки только сертифицированных семян или семян, выращенных под официальным контролем для всех культур картофеля в этой зоне, и проведения испытаний после сбора урожая семенного картофеля, выращенного в местах производства, определенных как вероятно загрязненные в соответствии со Статьей 5(1)(a)(iii). ),

- требовать раздельного обращения с заготовленным семенным фондом картофеля и товарным запасом во всех помещениях зоны,

- провести официальный опрос, как подробно описано в Статье 2(1),

(ab) в случаях, когда поверхностные воды были определены как загрязненные согласно Статье 5(1)(c)(ii) или включены в число элементов возможного распространения организма в соответствии с пунктом 2 Приложения V,

- проводить ежегодное обследование в подходящее время, включая отбор проб поверхностных вод и соответствующих растений-хозяев пасленовых в соответствующих источниках воды и тестирование в соответствии с

- для внесенного в список растительного материала соответствующий метод, указанный в Приложении II, или

- в остальных случаях любой другой официально одобренный метод,

- ввести официальный контроль над программами орошения и опрыскивания, включая запрет на использование воды, признанной зараженной, для орошения и опрыскивания перечисленных растительных материалов и, при необходимости, других растений-хозяев, чтобы предотвратить распространение организма. Этот запрет может быть пересмотрен на основании результатов, полученных в ходе указанного ежегодного опроса.

- в случае загрязнения сбросов жидких отходов ввести официальный контроль за удалением отходов предприятий промышленной переработки или упаковки, работающих с включенным растительным сырьем;

(b) разработать программу, где это возможно, для замены всех запасов семенного картофеля в течение соответствующего периода времени.

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

Официально утвержденные объекты по удалению отходов, упомянутые в четвертом абзаце параграфа 1 Приложения VI, должны соответствовать следующим положениям, чтобы исключить риск распространения организма:

(i) отходы переработки картофеля и томатов (включая бракованный картофель, кожуру и помидоры) и любые другие твердые отходы, связанные с картофелем и томатами, должны удаляться либо:

- глубокое захоронение на свалке, при котором отсутствует риск просачивания на сельскохозяйственные угодья или контакта с источниками воды, которые могут быть использованы для орошения сельскохозяйственных угодий. Отходы должны доставляться непосредственно на площадку в условиях локализации, исключающих риск потери отходов, или

- сжигание;

(ii) жидкие отходы переработки: перед утилизацией жидкие отходы, содержащие взвешенные твердые вещества, должны быть подвергнуты процессам фильтрации или отстаивания для удаления таких твердых веществ. Эти твердые вещества подлежат удалению, как указано в подпункте (i).

В таком случае жидкие отходы должны быть либо:

- нагреты минимум до 70 °C в течение не менее 30 минут перед утилизацией, или

- утилизировать иным образом при условии официального разрешения и под официальным контролем таким образом, чтобы не было риска контакта отходов с сельскохозяйственными угодьями или источниками воды, которые можно было бы использовать для орошения сельскохозяйственных земель. Подробности об этом должны быть доведены до сведения других государств-членов ЕС и Комиссии.