Директива Комиссии 1999/27/EC от 20 апреля 1999 г., устанавливающая методы анализа Сообщества для определения ампролия, диклазурила и карбадокса в кормах и вносящая поправки в Директивы 71/250/EEC, 73/46/EEC и отменяющая Директиву 74/203/EEC ( Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

ДИРЕКТИВА КОМИССИИ 1999/27/EC

от 20 апреля 1999 г.

установление методов Сообщества для определения ампролиума, диклазурила и карбадокса в кормах и внесение поправок в Директивы 71/250/EEC, 73/46/EEC и отмена Директивы 74/203/EEC

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 70/373/EEC от 20 июля 1970 г. о введении методов Сообщества отбора проб и анализа для официального контроля кормов(1), с последними поправками, внесенными Актом о присоединении Австрии, Финляндии и Швеции, и в частности, статью 2 этого документа,

(1) Принимая во внимание, что Директива 70/373/EEC предусматривает, что официальный контроль кормов с целью проверки соответствия требованиям, возникающим в соответствии с законами, постановлениями и административными положениями, регулирующими их качество и состав, должен осуществляться с использованием методов отбора проб и анализа Сообщества. ;

(2) Принимая во внимание, что Директива Совета 70/524/EEC от 23 ноября 1970 г. о добавках в кормах(2) с последними поправками, внесенными Регламентом Комиссии 45/1999(3), предусматривает, что содержание ампролия и диклазурила должно быть указано на этикетке, если они вещества добавляются в премиксы и корма; поскольку разрешение на использование карбадокса в качестве кормовой добавки было отозвано Регламентом Комиссии 2788/98 от 22 декабря 1998 г., вносящим поправки в Директиву Совета 70/524/EEC относительно добавок в кормах в отношении отзыва разрешения на использование некоторых стимуляторов роста(4) и необходим официальный контроль за возможным незаконным использованием запрещенных веществ;

(3) Принимая во внимание, что для проверки этих веществ должны быть установлены методы анализа Сообщества;

(4) Принимая во внимание, что первая Директива Комиссии 71/250/EEC от 15 июня 1971 года, устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов(5), с последними поправками, внесенными Директивой 98/54/EC(6), устанавливает методы анализа для, среди прочего, определения горчичного масла и теобромина; поскольку описанные методы более не применимы в свете достижений научно-технических знаний для использования по назначению; поскольку поэтому целесообразно удалить эти методы;

(5) Принимая во внимание, что четвертая Директива Комиссии 73/46/EEC от 5 декабря 1972 года, устанавливающая методы анализа Сообщества для официального контроля кормов(7), с последними поправками, внесенными Директивой 98/54/EC, устанавливает методы анализа для, inter кроме того, определение ретинола (витамина А); поскольку описанный метод более не действителен в свете достижений научно-технических знаний для предполагаемой цели; тогда как поэтому целесообразно исключить метод для ретинола;

(6) Принимая во внимание, что пятая Директива Комиссии 74/203/EEC от 25 марта 1974 г., устанавливающая методы Сообщества анализа для официального контроля кормов(8), с последними поправками, внесенными Директивой 81/680/EEC(9), устанавливает методы анализ для определения крахмала и продуктов его высокомолекулярной деградации в кормах, содержащих свекольную стружку, свекловичный жом, сушеную свекольную ботву или листья, картофельный жом, сухие дрожжи, продукты, богатые инулином или шкварками, ампролиум, этопабат, динитолмид, никарбазин и менадион (витамин К3); поскольку все методы, описанные в этой Директиве, больше не действительны в свете достижений научно-технических знаний для использования по назначению; поскольку поэтому целесообразно отменить настоящую Директиву;

(7) Поскольку меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Постоянного комитета по кормам,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

Государства-члены должны обеспечить, чтобы анализы, проводимые с целью официального контроля содержания ампролиума, диклазурила и карбадокса в кормах и премиксах, проводились с использованием методов, изложенных в Приложении к настоящему Соглашению.

Статья 2

В Директиву 71/250/EEC внесены следующие поправки.

1. В статье 1 слова "горчичное масло" и "теобромин" исключить.

2. Пункты 8 и 13 приложения исключить.

Статья 3

В Директиву 73/46/EEC внесены следующие поправки.

1. Статья 2 исключена.

2. Приложение II удалено.

Статья 4

Директива 74/203/EEC отменена.

Статья 5

Государства-члены должны ввести в силу не позднее 31 октября 1999 г. законы, постановления или административные положения, необходимые для соблюдения положений настоящей Директивы. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Они начнут применять эти меры с 1 ноября 1999 года.

Когда государства-члены ЕС принимают эти меры, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой во время их официальной публикации. Порядок такой ссылки должен быть принят государствами-членами.

Статья 6

Настоящая Директива вступает в силу на 20-й день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 7

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 20 апреля 1999 года.

Для Комиссии

Франц ФИШЛЕР

Член Комиссии

(1) OJ L 170, 3 августа 1970 г., с. 2.

(2) OJ L 270, 14.12.1970, с. 1.

(3) ОЖ L 6, 12 января 1999 г., с. 3.

(4) OJ L 347, 23 декабря 1998 г., с. 31.

(5) OJ L 155, 12 июля 1971 г., с. 13.

(6) OJ L 208, 24 июля 1998 г., с. 49.

(7) OJ L 83, 30 марта 1973 г., с. 21.

(8) OJ L 108, 22 апреля 1974 г., с. 7.

(9) OJ L 246, 29 августа 1981 г., с. 32.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Часть А

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМПРОЛИЯ

1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метилпиридиния хлорид гидрохлорид

1. Цель и сфера применения

Этот метод предназначен для определения ампролия в кормах и премиксах. Предел обнаружения 1 мг/кг, предел определения 25 мг/кг.

2. Принцип

Пробу экстрагируют смесью метанола и воды. После разбавления подвижной фазой и мембранной фильтрации содержание ампролия определяют методом катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора.

3. Реагенты

3.1. Метанол.

3.2. Ацетонитрил, сорт для ВЭЖХ.

3.3. Вода, степень ВЭЖХ.

3.4. Раствор дигидрофосфата натрия, с = 0,1 моль/л

13,80 г натрия дигидрофосфата моногидрата растворяют в воде (3.3) в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят до метки водой (3.3) и перемешивают.

3.5. Раствор перхлората натрия, c = 1,6 моль/л

224,74 г натрия перхлората моногидрата растворяют в воде (3.3) в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят до метки водой (3.3) и перемешивают.

3.6. Подвижная фаза для ВЭЖХ (см. наблюдение 9.1).

Смесь ацетонитрила (3.2), раствора дигидрофосфата натрия (3.4) и раствора перхлората натрия (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Перед использованием профильтровать через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм (4.3) и дегазировать раствор (например, в ультразвуковой ванне (4.4) в течение не менее 15 минут).

3.7. Стандартное вещество: ампролий чистый, гидрохлорид 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метилпиридиния, Е 750 (см. 9.2).

3.7.1. Исходный стандартный раствор ампролиума, 500 мкг/мл

Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 50 мг ампролия (3.7) в градуированной колбе вместимостью 100 мл, растворяют в 80 мл метанола (3.1) и помещают колбу на 10 мин в ультразвуковую баню (4.4). После ультразвуковой обработки доведите раствор до комнатной температуры, доведите водой до метки и перемешайте. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.7.2. Промежуточный стандартный раствор ампролиума, 50 мкг/мл

Внесите пипеткой 5 мл исходного стандартного раствора (3.7.1) в градуированную колбу вместимостью 50 мл, доведите до метки экстракционным растворителем (3.8) и перемешайте. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.7.3. Калибровочные решения

Переносят 0,5, 1 и 2 мл промежуточного стандартного раствора (3.7.2). в серию градуированных колб емкостью 50 мл. Доведите до метки подвижной фазой (3.6) и перемешайте. Эти растворы соответствуют 0,5, 1 и 2 мкг ампролия на мл соответственно. Эти растворы должны быть приготовлены свежими перед использованием.

3.8. Экстракционный растворитель

Смесь метанол (3.1)-вода 2+1 (v+v).

4. Аппарат

4.1. Оборудование для ВЭЖХ с системой впрыска, подходящее для объемов впрыска 100 мкл.

4.1.1. Жидкостная хроматографическая колонка 125 мм х 4 мм, катионообменник Nucleosil 10 SA, насадка 10 мкм или эквивалент

4.1.2. УФ-детектор с регулируемой длиной волны или детектор с диодной матрицей.

4.2. Мембранный фильтр, материал ПТФЭ, 0,45 мкм.

4.3. Мембранный фильтр, 0,22 мкм.

4.4. Ультразвуковая ванна.

4.5. Механический шейкер или магнитная мешалка.

5. Процедура

5.1. Общий

5.1.1. Пустой канал

Для проведения теста на восстановление (5.1.2) необходимо проанализировать холостое сырье, чтобы убедиться в отсутствии ампролия и мешающих веществ. Холостой исходный материал должен быть аналогичен типу образца, и ампролий или мешающие вещества не должны быть обнаружены.

5.1.2. Тест восстановления

Тест на восстановление следует проводить путем анализа контрольного корма, обогащенного добавлением количества ампролия, аналогичного количеству, присутствующему в образце. Для обогащения до уровня 100 мг/кг переносят 10 мл исходного стандартного раствора (3.7.1) в коническую колбу вместимостью 250 мл и выпаривают раствор примерно до 0,5 мл. Добавьте 50 г чистого корма, тщательно перемешайте и оставьте на 10 минут, еще раз несколько раз перемешав, прежде чем приступить к этапу экстракции (5.2).

Альтернативно, если нет холостого сырья, аналогичного типу образца (см. 5.1.1), можно провести испытание на восстановление с помощью стандартного метода добавления. В этом случае анализируемый образец обогащается количеством ампролия, аналогичным тому, которое уже присутствует в образце. Этот образец анализируется вместе с необогащенным образцом, и извлечение можно рассчитать путем вычитания.

5.2. Добыча

5.2.1. Премиксы (содержание < 1 % ампролия) и корма

Взвешивают с точностью до 0,01 г, от 5 до 40 г образца в зависимости от содержания ампролия в коническую колбу вместимостью 500 мл и добавляют 200 мл экстракционного растворителя (3.8). Поместите колбу в ультразвуковую ванну (4.4) и оставьте на 15 минут. Вынимают колбу из ультразвуковой бани и встряхивают ее в течение 1 часа на шейкере или перемешивают на магнитной мешалке (4.5). Разведите аликвоту экстракта подвижной фазой (3.6) до содержания ампролия от 0,5 до 2 мкг/мл и перемешайте (см. наблюдение 9.3). Отфильтруйте от 5 до 10 мл этого разбавленного раствора на мембранном фильтре (4.2). Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.2.2. Премиксы (содержание >= 1 % ампролия)

Взвешивают с точностью до 0,001 г от 1 до 4 г премикса в зависимости от содержания ампролия в коническую колбу вместимостью 500 мл и добавляют 200 мл экстракционного растворителя (3.8). Поместите колбу в ультразвуковую ванну (4.4) и оставьте на 15 минут. Вынимают колбу из ультразвуковой бани и встряхивают ее в течение 1 часа на шейкере или перемешивают на магнитной мешалке (4.5). Аликвоту экстракта с подвижной фазой (3.6) разводят до содержания ампролия от 0,5 до 2 мкг/мл и перемешивают. Отфильтруйте от 5 до 10 мл этого разбавленного раствора на мембранном фильтре (4.2). Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.3. Определение ВЭЖХ

5.3.1. Параметры:

Следующие условия предлагаются в качестве руководства; можно использовать и другие условия при условии, что они дают эквивалентные результаты.

>ТАБЛИЦА>

Проверяют стабильность хроматографической системы, несколько раз вводя калибровочный раствор (3.7.3), содержащий 1,0 мкг/мл, до достижения постоянной высоты пика и времени удерживания.

5.3.2. Калибровочный график

Вводят каждый калибровочный раствор (3.7.3) несколько раз и определяют среднюю высоту пика (площадь) для каждой концентрации. Постройте калибровочный график, используя средние высоты пиков (площади) калибровочных растворов по оси ординат и соответствующие концентрации в мкг/мл по оси абсцисс.

5.3.3. Пример решения

Вводят экстракт образца (5.2) несколько раз, используя тот же объем, что и калибровочные растворы, и определяют среднюю высоту (площадь) пиков ампролия.

6. Подсчет результатов

По средней высоте (площади) пиков ампролия раствора пробы определяют концентрацию раствора пробы в мкг/мл, сверяясь с калибровочным графиком (5.3.2).

Содержание ампролия w в мг/кг образца определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

[мг/кг], в котором:

V= объем экстракционного растворителя (3.8) в мл согласно 5.2 (т.е. 200 мл)

β = концентрация ампролия в экстракте образца (5.2), мкг/мл.

f= коэффициент разбавления согласно 5.2

m = масса исследуемой навески в г

7. Проверка результатов

7.1. Личность

Идентичность аналита может быть подтверждена совместной хроматографией или использованием диодно-матричного детектора, с помощью которого сравниваются спектры экстракта пробы (5.2) и калибровочного раствора (3.7.3), содержащего 2,0 мкг/мл. .

7.1.1. Кохроматография

Экстракт образца (5.2) обогащают добавлением соответствующего количества калибровочного раствора (3.7.3). Количество добавленного ампролия должно быть аналогично количеству ампролия, обнаруженного в экстракте образца.

Следует увеличивать только высоту пика ампролия с учетом как добавленного количества, так и разбавления экстракта. Ширина пика на половине его высоты должна находиться в пределах +- 10 % от исходной ширины пика ампролия необогащенного экстракта образца.

7.1.2. Обнаружение диодной матрицы

Результаты оцениваются по следующим критериям:

(a) Длина волны максимального поглощения образца и стандартного спектра, записанная на вершине пика хроматограммы, должна быть одинаковой в пределах, определяемых разрешающей способностью системы обнаружения. Для обнаружения с помощью диодной матрицы это обычно находится в пределах +- 2 нм.

(b) Между 210 и 320 нм спектры образца и стандарта, записанные на вершине пика хроматограммы, не должны отличаться для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне 10–100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется, когда присутствуют одни и те же максимумы и ни в одной наблюдаемой точке отклонение между двумя спектрами не превышает 15 % оптической плотности стандартного аналита.

(c) Между 210 и 320 нм спектры подъема, вершины и спада пика, полученного экстрактом образца, не должны отличаться друг от друга для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне 10–100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется при наличии одинаковых максимумов и когда во всех наблюдаемых точках отклонение между спектрами не превышает 15 % оптической плотности спектра вершины пика.

Если один из этих критериев не соответствует, присутствие аналита не подтверждено.

7.2. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать

- 15 % относительно более высокого значения для содержания ампролия от 25 мг/кг до 500 мг/кг.

- 75 мг/кг при содержании ампролия от 500 до 1000 мг/кг.

- 7,5 % относительно более высокого значения при содержании ампролия более 1000 мг/кг.

7.3. Восстановление

Для обогащенной (холостой) пробы извлечение должно составлять не менее 90 %.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование, в ходе которого были проанализированы три корма для птицы (образец 1-3), один минеральный корм (образец 4) и один премикс (образец 5). Результаты приведены в следующей таблице.

>ТАБЛИЦА>

L: количество лабораторий.

n: количество одиночных значений.

sr: стандартное отклонение повторяемости.

CVr: коэффициент вариации повторяемости.

sR: стандартное отклонение воспроизводимости.

CVR: коэффициент вариации воспроизводимости.

9. Наблюдения

9.1. Если образец содержит тиамин, пик тиамина на хроматограмме появляется незадолго до пика ампролия. Следуя этому методу, необходимо разделить ампролий и тиамин. Если ампролий и тиамин не разделяются на колонке (4.1.1), используемой в этом методе, заменяют до 50 % ацетонитриловой части подвижной фазы (3.6) метанолом.

9.2. Согласно Британской фармакопее, в спектре раствора ампролия (с = 0,02 моль/л) в соляной кислоте (с = 0,1 моль/л) наблюдаются максимумы при 246 нм и 262 нм. Поглощение должно составлять 0,84 при 246 нм и 0,80 при 262 нм.

9.3. Экстракт всегда необходимо разбавлять подвижной фазой, поскольку в противном случае время удерживания пика ампролия может значительно сдвинуться из-за изменения ионной силы.

ЧАСТЬ Б

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИКЛАЗУРИЛА

(+)-4-хлорфенил[2,6-дихлор-4-(2,3,4,5-тетрагидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил]ацетонитрил.

1. Цель и сфера применения

Метод предназначен для определения диклазурила в кормах и премиксах. Предел обнаружения 0,1 мг/кг, предел определения 0,5 мг/кг.

2. Принцип

После добавления внутреннего стандарта пробу экстрагируют подкисленным метанолом. Для кормов аликвоту экстракта очищают на картридже твердофазной экстракции C18. Диклазурил элюируют из картриджа смесью подкисленного метанола и воды. После выпаривания остаток растворяют в смеси ДМФ/вода. В случае премиксов экстракт выпаривают, а остаток растворяют в смеси ДМФ/вода. Содержание диклазурила определяют методом тройной градиентной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора.

3. Реагенты

3.1. Вода, чистота для ВЭЖХ.

3.2. Ацетат аммония.

3.3. Гидросульфат тетрабутиламмония (TBHS).

3.4. Ацетонитрил, сорт для ВЭЖХ.

3.5. Метанол, степень ВЭЖХ.

3.6. N,N-диметилформамид (ДМФ).

3.7. Соляная кислота, ρ20 = 1,19 г/мл.

3.8. Стандартное вещество: диклазурил II-24: (+)-4-хлорфенил [2,6-дихлор-4-(2,3,4,5-тетрагидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2) -ил)фенил]ацетонитрил гарантированной чистоты, Е771.

3.8.1. Стандартный раствор диклазурила, 500 мкг/мл.

Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 25 мг стандартного вещества диклазурила (3.8) в градуированной колбе вместимостью 50 мл. Растворить в ДМФ (3,6), довести ДМФ (3,6) до метки и перемешать. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте янтарную колбу и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.8.2. Диклазурил стандартный раствор, 50 мкг/мл.

5,00 мл исходного стандартного раствора (3.8.1.) переносят в градуированную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки ДМФА (3.6) и перемешивают. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте янтарную колбу и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.9. Внутренний стандарт: 2,6-дихлор-а-(4-хлорфенил)-4-(4,5 дигидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2(3H)-ил)-метилбензол- ацетонитрил.

3.9.1. Внутренний стандартный раствор, 500 мкг/мл.

Взвешивают с точностью до 0,1 мг 25 мг внутреннего стандарта (3.9) в градуированной колбе вместимостью 50 мл. Растворить в ДМФ (3,6), довести ДМФ (3,6) до метки и перемешать. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте янтарную колбу и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.9.2. Раствор внутреннего стандарта, 50 мкг/мл.

Переносят 5,00 мл внутреннего маточного стандартного раствора (3.9.1) в градуированную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки ДМФА (3.6) и перемешивают. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте янтарную колбу и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.9.3. Раствор внутреннего стандарта для премиксов, р/1000 мг/мл (р = номинальное содержание диклазурила в премиксе, мг/кг).

Вещество внутреннего стандарта взвешивают с точностью до 0,1 мг/10 мг в градуированной колбе вместимостью 100 мл, растворяют в ДМФ (3.6) в ультразвуковой ванне (4.6), доводят до метки ДМФ и перемешивают. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте янтарную колбу и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.10. Калибровочный раствор, 2 мкг/мл.

Внесите пипеткой 2,00 мл стандартного раствора диклазурила (3.8.2) и 2,00 мл раствора внутреннего стандарта (3.9.2) в градуированную колбу вместимостью 50 мл. Добавьте 16 мл ДМФ (3,6), доведите водой до метки и перемешайте. Этот раствор должен быть приготовлен свежеприготовленным перед применением.

3.11. Картридж для твердофазной экстракции C18, например. Bond Elut, объем: 1 мл, масса сорбента: 100 мг.

3.12. Растворитель для экстракции: подкисленный метанол.

Пипеткой внесите 5,0 мл соляной кислоты (3,7) в 1000 мл метанола (3,5) и перемешайте.

3.13. Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Элюент А: раствор ацетата аммония - гидросульфата тетрабутиламмония.

3.13.1. 5 г ацетата аммония (3.2) и 3,4 г ТБХС (3.3) растворяют в 1000 мл воды (3.1) и перемешивают.

3.13.2. Элюент Б: ацетонитрил (3.4).

3.13.3. Элюент С: метанол (3,5).

4. Аппарат

4.1. Механический шейкер.

4.2. Оборудование для тройной градиентной ВЭЖХ.

4.2.1. Колонка для жидкостной хроматографии Hypersil ODS, насадка 3 мкм, 100 x 4,6 мм или эквивалентная.

4.2.2. УФ-детектор с регулируемой длиной волны или детектор с диодной матрицей.

4.3. Вакуумный ротационный испаритель

4.4. Мембранный фильтр, 0,45 мкм.

4.5. Вакуумный коллектор.

4.6. Ультразвуковая ванна.

5. Процедура

5.1. Общий

5.1.1. Пустой канал

Холостой корм следует проанализировать, чтобы убедиться в отсутствии диклазурила и мешающих веществ. Холостой корм должен быть аналогичен типу образца, и при анализе не должно быть обнаружено диклазурила или мешающих веществ.

5.1.2. Тест восстановления

Тест на восстановление следует проводить путем анализа контрольного корма, который был обогащен добавлением количества диклазурила, аналогичного количеству, присутствующему в образце. Для обогащения на уровне 1 мг/кг добавляют 0,1 мл исходного стандартного раствора (3.8.1.) к 50 г холостого корма, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин, несколько раз перемешивая перед продолжением (5.2). .).

Альтернативно, если нет холостого сырья, аналогичного типу образца (см. 5.1.1), можно провести испытание на восстановление с помощью стандартного метода добавления. В этом случае анализируемый образец обогащается количеством диклазурила, аналогичным тому, которое уже присутствует в образце. Этот образец анализируется вместе с необогащенным образцом, и извлечение может быть рассчитано путем вычитания.

5.2. Добыча

5.2.1. Корма

Взвесьте с точностью до 0,01 г примерно 50 г образца. Переносят в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 1,00 мл раствора внутреннего стандарта (3.9.2), 200 мл экстракционного растворителя (3.12) и закрывают колбу пробкой. Встряхивайте смесь на шейкере (4.1) в течение ночи. Дать отстояться 10 минут. Перенесите аликвоту надосадочной жидкости объемом 20 мл в подходящий стеклянный контейнер и разбавьте 20 мл воды. Перенесите этот раствор в картридж для экстракции (3.11) и пропустите его с помощью вакуума (4.5.). Промывают картридж 25 мл смеси экстракционного растворителя (3.12) и воды, 65 + 35 (V + V). Собранные фракции отбрасывают и элюируют соединения 25 мл смеси экстракционного растворителя (3.12) и воды, 80 + 20 (V + V). Эту фракцию выпаривают до полного высыхания с помощью роторного испарителя (4.3) при температуре 60 °С. Остаток растворяют в 1,0 мл ДМФ (3.6), добавляют 1,5 мл воды (3.1) и перемешивают. Фильтруют через мембранный фильтр (4.4). Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.2.2. Премиксы

Взвешивают с точностью до 0,001 г примерно 1 г образца. Переносят в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 1,00 мл раствора внутреннего стандарта (3.9.3), 200 мл экстракционного растворителя (3.12) и закрывают колбу пробкой. Встряхивайте смесь на шейкере (4.1) в течение ночи. Дать отстояться 10 минут. Перенесите аликвоту 10 000/мл (р = номинальное содержание диклазурила в премиксе в мг/кг) супернатанта в круглодонную колбу подходящего размера. Выпаривают до полного высыхания при пониженном давлении и температуре 60 °С с помощью роторного испарителя (4.3). Остаток повторно растворяют в 10,0 мл ДМФ (3.6), добавляют 15,0 мл воды (3.1) и перемешивают. Переходят к определению ВЭЖХ (5.3).

5.3. Определение ВЭЖХ

5.3.1. Параметры

Следующие условия предлагаются в качестве руководства; можно использовать и другие условия при условии, что они дают эквивалентные результаты.

>ТАБЛИЦА>

Проверяют стабильность хроматографической системы, несколько раз вводя калибровочный раствор (3.10), содержащий 2 мкг/мл, до достижения постоянной высоты пика и времени удерживания.

5.3.2. Калибровочное решение

Вводят несколько раз по 20 мкл калибровочного раствора (3.10) и определяют среднюю высоту (площадь) пиков диклазурила и внутреннего стандарта.

5.3.3. Пример решения

Вводят 20 мкл раствора образца (5.2.1 или 5.2.2) несколько раз и определяют среднюю высоту (площадь) пиков диклазурила и внутреннего стандарта.

6. Подсчет результатов

6.1. Ленты

Содержание диклазурила w (мг/кг) в образце определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

[мг/кг]где

hd,s = высота (площадь) пика диклазурила в растворе образца (5.2.1)

hi,s = высота (площадь) пика внутреннего стандарта в растворе пробы (5.2.1)

hd,c = высота (площадь) пика диклазурила в калибровочном растворе (3.10)

hi,c = высота пика (площадь) внутреннего стандарта в калибровочном растворе (3.10)

βd,c = концентрация диклазурила в калибровочном растворе, мкг/мл (3.10)

m = масса навески в г.

V = объем экстракта пробы согласно 5.2.1 (т.е. 2,5 мл).

6.2. Премиксы

Содержание диклазурила w (мг/кг) в пробе определяется по формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

[мг/кг]где

hd,c = высота (площадь) пика диклазурила в калибровочном растворе (3.10)

hi,c = высота пика (площадь) внутреннего стандарта в калибровочном растворе (3.10)

hd,s = высота (площадь) пика диклазурила в растворе образца (5.2.2)

hi,s = высота (площадь) пика внутреннего стандарта в растворе пробы (5.2.2)

βd,c = концентрация диклазурила в калибровочном растворе (3.10)

m = масса навески в г.

V = объем экстракта пробы согласно 5.2.2 (т.е. 25 мл).

p = номинальное содержание диклазурила в мг/кг в премиксе.

7. Проверка результатов

7.1. Личность

Идентичность аналита можно подтвердить с помощью совместной хроматографии или с помощью диодно-матричного детектора, с помощью которого сравнивают спектры экстракта пробы (5.2.1 или 5.2.2) и калибровочного раствора (3.10).

7.1.1. Кохроматография

Экстракт образца (5.2.1 или 5.2.2) обогащают добавлением соответствующего количества калибровочного раствора (3.10). Количество добавленного диклазурила должно быть аналогично количеству диклазурила, обнаруженному в экстракте образца.

Следует увеличивать только высоту пика диклазурила и пика внутреннего стандарта с учетом как добавленного количества, так и разведения экстракта. Ширина пика на половине его высоты должна находиться в пределах +- 10 % от исходной ширины пика диклазурила или пика внутреннего стандарта необогащенного экстракта образца.

7.1.2. Обнаружение диодной матрицы

Результаты оцениваются по следующим критериям:

(a) Длина волны максимального поглощения образца и стандартного спектра, записанная на вершине пика хроматограммы, должна быть одинаковой в пределах, определяемых разрешающей способностью системы обнаружения. Для обнаружения с помощью диодной матрицы это обычно находится в пределах +- 2 нм.

(b) Между 230 и 320 нм спектры образца и стандарта, записанные на вершине пика хроматограммы, не должны отличаться для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне 10–100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется, когда присутствуют одни и те же максимумы и ни в одной наблюдаемой точке отклонение между двумя спектрами не превышает 15 % оптической плотности стандартного аналита.

(c) Между 230 и 320 нм спектры подъема, вершины и спада пика, полученного экстрактом образца, не должны отличаться друг от друга для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне 10–100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется при наличии одинаковых максимумов и когда во всех наблюдаемых точках отклонение между спектрами не превышает 15 % оптической плотности спектра вершины пика.

Если один из этих критериев не соответствует, присутствие аналита не подтверждено.

7.2. Повторяемость

Разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать:

- 30 % относительно более высокого значения для содержания диклазурила от 0,5 мг/кг до 2,5 мг/кг.

- 0,75 мг/кг при содержании диклазурила от 2,5 мг/кг до 5 мг/кг.

- 15 % относительно более высокого значения при содержании диклазурила более 5 мг/кг.

7.3. Восстановление

Для обогащенной (холостой) пробы извлечение должно составлять не менее 80 %.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование, в ходе которого пять образцов были проанализированы 11 лабораториями. Эти образцы состояли из двух премиксов; один был смешан с органической матрицей (О 100), а другой - с неорганической матрицей (А 100). Теоретическое содержание диклазурила составляет 100 мг на кг. Три комбикорма для птицы были изготовлены тремя разными производителями (Нидерланды) (L1/Z1/K1). Теоретическое содержание диклазурила составляет 1 мг на кг. Лабораториям было поручено проанализировать каждый из образцов один раз или в двух экземплярах. (Более подробную информацию об этом совместном исследовании можно найти в журнале AOAC International, том 77, № 6, 1994 г., стр. 1359-1361). Результаты приведены в следующей таблице:

>ТАБЛИЦА>

L= количество лабораторий.

n = количество одиночных значений.

sr= Стандартное отклонение повторяемости.

CVr= коэффициент вариации повторяемости.

SR = стандартное отклонение воспроизводимости.

CVR = коэффициент вариации воспроизводимости.

9. Наблюдения

Ранее должно было быть продемонстрировано, что реакция на диклазурил является линейной в диапазоне измеряемых концентраций.

Часть С

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРБАДОКСА

Метил-3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1,N4-диоксид

1. Цель и сфера применения

Этот метод предназначен для определения карбадокса в кормах, премиксах и препаратах. Предел обнаружения составляет 1 мг/кг. Предел определения – 10 мг/кг.

2. Принцип

Пробу уравновешивают водой и экстрагируют метанолом-ацетонитрилом. В случае кормов аликвотную часть отфильтрованного экстракта подвергают очистке на колонке с оксидом алюминия. Для премиксов и препаратов аликвотную часть отфильтрованного экстракта разбавляют до соответствующей концентрации водой, метанолом и ацетонитрилом. Содержание карбадокса определяют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора.

3. Реагенты

3.1. Метанол.

3.2. Ацетонитрил, сорт для ВЭЖХ.

3.3. Уксусная кислота, w = 100 %.

3.4. Оксид алюминия: нейтральный, класс активности I.

3.5. Метанол-ацетонитрил 1+л (v+v).

Смешайте 500 мл метанола (3.1) с 500 мл ацетонитрила (3.2).

3.6. Уксусная кислота, σ = 10 %.

10 мл уксусной кислоты (3.3) разбавьте водой до 100 мл.

3.7. Ацетат натрия, CH3COONa.

3.8. Вода, степень ВЭЖХ.

3.9. Ацетатный буферный раствор, с = 0,01 моль/л, pH = 6,0.

0,82 г ацетата натрия (3.7) растворяют в 700 мл воды (3.8) и доводят pH до 6,0 уксусной кислотой (3.6). Переливают в градуированную колбу вместимостью 1000 мл, доводят водой до метки (3.8) и перемешивают.

3.10. Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Смешайте 825 мл ацетатного буферного раствора (3.9) с 175 мл ацетонитрила (3.2). Фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм (4.5) и дегазируют раствор (например, ультразвуком в течение 10 минут).

3.11. Стандартное вещество.

Чистый карбадокс: Метил 3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1,N4-диоксид, E 850.

3.11.1. Стандартный раствор карбадокса, 100 мкг/мл (см. процедуру пункта 5):

Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 25 мг стандартного вещества карбадокса (3.11) в градуированную колбу вместимостью 250 мл. Растворяют в смеси метанол-ацетонитрил (3.5) с помощью ультразвука (4.7). После ультразвуковой обработки раствор доводят до комнатной температуры, доводят до метки метанолом-ацетонитрилом (3,5) и перемешивают. Оберните колбу алюминиевой фольгой или используйте посуду из янтарного стекла и храните в холодильнике. При температуре <= 4°C раствор стабилен в течение одного месяца.

3.11.2. Калибровочные решения

Переносят 2,0, 5,0, 10,0 и 20,0 мл исходного стандартного раствора (3.11.1) в серию калиброванных колб вместимостью 100 мл. Добавьте 30 мл воды, доведите до метки метанолом-ацетонитрилом (3,5) и перемешайте. Оберните колбу алюминиевой фольгой. Эти растворы соответствуют 2,0, 5,0, 10,0 и 20,0 мкг/мл карбадокса соответственно. Калибровочные растворы должны быть свежеприготовленными перед использованием.

Примечание:

Для определения карбадокса в кормах с содержанием менее 10 мг/кг необходимо готовить калибровочные растворы с концентрацией менее 2,0 мкг/мл.

3.12. Смесь вода-[метанол-ацетонитрил] (3,5), 300 + 700 (об + об)

Смешать 300 мл воды с 700 мл смеси метанол-ацетонитрил (3,5).

4. Аппарат

4.1. Лабораторный шейкер или магнитная мешалка.

4.2. Фильтровальная бумага из стекловолокна (Whatman GF/A или эквивалент).

4.3. Стеклянная колонка (длина от 300 до 400 мм, внутренний диаметр около 10 мм) с фриттой из спеченного стекла и отводным клапаном.

Примечание:

также можно использовать стеклянную колонку с запорным краном или стеклянную колонку с коническим концом; в этом случае в нижний конец вставляют небольшую стекловатную пробку и утрамбовывают ее стеклянным стержнем

4.4. Оборудование для ВЭЖХ с системой впрыска, подходящее для объемов впрыска 20 мкл.

4.4.1. Жидкостная хроматографическая колонка: 300 мм x 4 мм, C18, упаковка 10 мкм или эквивалентная.

4.4.2. УФ-детектор с регулируемой длиной волны или детектор с диодной матрицей, работающий в диапазоне от 225 до 400 нм.

4.5. Мембранный фильтр, 0,22 мкм.

4.6. Мембранный фильтр, 0,45 мкм.

4.7. Ультразвуковая ванна.

5. Процедура

Примечание:

Карбадокс чувствителен к свету. Все процедуры проводите при приглушенном свете или используйте посуду янтарного цвета или стеклянную посуду, завернутую в алюминиевую фольгу.

5.1. Общий

5.1.1. Пустой канал.

Для проведения теста на восстановление (5.1.2) необходимо проанализировать холостое сырье, чтобы убедиться в отсутствии карбадокса и мешающих веществ. Холостой исходный материал должен быть аналогичен типу образца, и при анализе не должно быть обнаружено карбадокса или мешающих веществ.

5.1.2. Тест восстановления.

Испытание на восстановление следует проводить путем анализа холостого корма (5.1.1), обогащенного добавлением количества карбадокса, аналогичного количеству, присутствующему в образце. Для обогащения до уровня 50 мг/кг переносят 5,0 мл исходного стандартного раствора (3.11.1) в коническую колбу вместимостью 200 мл. Упаривают раствор примерно до 0,5 мл в токе азота. Добавьте 10 г чистого корма, перемешайте и подождите 10 минут, прежде чем приступить к этапу экстракции (5.2).

Альтернативно, если нет холостого сырья, аналогичного типу образца (см. 5.1.1), можно провести испытание на восстановление с помощью стандартного метода добавления. В этом случае образец обогащается количеством карбадокса, аналогичным тому, который уже присутствует в образце. Этот образец анализируется вместе с необогащенным образцом, и извлечение может быть рассчитано путем вычитания.

5.2. Добыча

5.2.1. Корма.

Взвесьте с точностью до 0,01 г примерно 10 г образца и перенесите в коническую колбу емкостью 200 мл. Добавьте 15,0 мл воды, перемешайте и уравновешивайте в течение 5 минут. Добавляют 35,0 мл смеси метанол-ацетонитрил (3.5), закрывают пробкой и встряхивают в течение 30 минут на шейкере или перемешивают на магнитной мешалке (4.1). Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу из стекловолокна (4.2). Сохраните этот раствор для этапа очистки (5.3).

5.2.2. Премиксы (0,1–2,0 %).

Взвесьте с точностью до 0,01 г (около 1 г) неизмельченную пробу и перенесите ее в коническую колбу емкостью 200 мл. Добавьте 15,0 мл воды, перемешайте и уравновешивайте в течение 5 минут. Добавляют 35,0 мл смеси метанол-ацетонитрил (3.5), закрывают пробкой и встряхивают в течение 30 минут на шейкере или перемешивают на магнитной мешалке (4.1). Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу из стекловолокна (4.2). Внесите пипеткой аликвоту фильтрата в калибровочную колбу емкостью 50 мл. Добавьте 15,0 мл воды, доведите до метки метанолом-ацетонитрилом (3,5) и перемешайте. Концентрация карбадокса в конечном растворе должна составлять примерно 10 мкг/мл. Аликвоту фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (4.6). Переходят к определению ВЭЖХ (5.4).

5.2.3. Препараты (> 2 %)

Взвесьте с точностью до 0,001 г примерно 0,2 г неразмолотой пробы и перенесите ее в коническую колбу емкостью 250 мл. Добавьте 45,0 мл воды, перемешайте и уравновесьте в течение 5 минут. Добавляют 105,0 мл смеси метанол-ацетонитрил (3,5), закрывают пробкой и гомогенизируют. Обрабатывайте образец ультразвуком (4.7) в течение 15 минут с последующим встряхиванием или перемешиванием в течение 15 минут (4.1). Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу из стекловолокна (4.2). Аликвоту фильтрата разбавляют смесью вода-метанол-ацетонитрил (3.12) до конечной концентрации карбадокса 10-15 мкг/мл (для 10 % препарата коэффициент разведения равен 10). Аликвоту фильтруют через фильтр 0,45 мкм (4.6). Переходят к определению ВЭЖХ (5.4).

5.3. Очистка

5.3.1. Подготовка колонки с оксидом алюминия.

Взвесьте 4 г оксида алюминия (3.4) и перенесите его в стеклянную колонку (4.3).

5.3.2. Очистка образца.

Наносят 15 мл отфильтрованного экстракта (5.2.1) на колонку с оксидом алюминия и отбрасывают первые 2 мл элюата. Соберите следующие 5 мл и отфильтруйте аликвоту через фильтр с размером пор 0,45 мкм (4.6). Переходят к определению ВЭЖХ (5.4).

5.4. Определение ВЭЖХ

5.4.1. Параметры

Следующие условия предлагаются в качестве руководства; можно использовать и другие условия, если они дают эквивалентные результаты.

>ТАБЛИЦА>

Проверяют стабильность хроматографической системы, несколько раз вводя калибровочный раствор (3.11.2), содержащий 5,0 мкг/мл, до достижения постоянной высоты пика (площади) и времени удерживания.

5.4.2. Калибровочный график.

Каждый калибровочный раствор (3.11.2) вводят несколько раз и измеряют высоту (площадь) пика для каждой концентрации. Постройте калибровочную кривую, используя средние высоты пиков или площади калибровочных растворов по оси ординат и соответствующие концентрации в мкг/мл по оси абсцисс.

5.4.3. Пример решения.

Вводят экстракт пробы [(5.3.2) для кормов, (5.2.2) для премиксов и (5.2.3) для препаратов] несколько раз и определяют среднюю высоту (площадь) пиков карбадокса.

6. Подсчет результатов

По средней высоте (площади) пиков карбадокса раствора пробы определяют концентрацию раствора пробы в мкг/мл, сверяясь с калибровочным графиком (5.4.2).

6.1. Корма:

Содержание карбадокса w (мг/кг) в пробе определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

[мг/кг], в котором:

β = концентрация карбадокса в экстракте пробы (5.3.2), мкг/мл.

V1= объем экстракции в мл (т.е. 50).

m = масса навески в г.

6.2. Премиксы и препараты.

Содержание карбадокса w (мг/кг) в пробе определяется по следующей формуле:

>ССЫЛКА НА ГРАФИКУ>

[мг/кг], в котором:

β = концентрация карбадокса в экстракте образца (5.2.2 или 5.2.3) в мкг/мл.

V2 = объем экстракции в мл (т.е. 50 для премиксов; 150 для препаратов).

f = коэффициент разбавления по 5.2.2 (премиксы) или 5.2.3 (препараты).

m = масса навески в г.

7. Проверка результатов

7.1. Личность.

Идентичность аналита можно подтвердить с помощью совместной хроматографии или с помощью диодно-матричного детектора, с помощью которого сравнивают спектры экстракта пробы и калибровочного раствора (3.11.2), содержащего 10,0 мкг/мл.

7.1.1. Кохроматография.

Экстракт пробы обогащают добавлением соответствующего количества калибровочного раствора (3.11.2). Количество добавленного карбадокса должно быть аналогично расчетному количеству карбадокса, обнаруженному в экстракте образца.

Следует увеличить только высоту пика карбадокса с учетом как добавленного количества, так и разбавления экстракта. Ширина пика на половине его максимальной высоты должна находиться в пределах примерно 10 % от исходной ширины.

7.1.2. Обнаружение диодной матрицы.

Результаты оцениваются по следующим критериям:

(a) длина волны максимального поглощения образца и стандартного спектра, записанная на вершине пика на хроматограмме, должна быть одинаковой в пределах, определяемых разрешающей способностью системы обнаружения. Для обнаружения с помощью диодной матрицы это обычно находится в пределах +- 2 нм;

(b) в диапазоне от 225 до 400 нм спектры образца и стандарта, записанные на вершине пика хроматограммы, не должны отличаться для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне от 10 до 100 % относительного поглощения. Этот критерий соблюдается, когда присутствуют одни и те же максимумы и ни в одной наблюдаемой точке отклонение между двумя спектрами не превышает 15 % оптической плотности стандартного аналита;

(c) в диапазоне 225–400 нм спектры подъема, вершины и спада пика, полученного экстрактом образца, не должны отличаться друг от друга для тех частей спектра, которые находятся в диапазоне от 10 до 100 % относительного поглощения. Этот критерий выполняется при наличии одинаковых максимумов и когда во всех наблюдаемых точках отклонение между спектрами не превышает 15 % оптической плотности спектра апекса.

Если один из этих критериев не соответствует, присутствие аналита не подтверждено.

7.2. Повторяемость.

При содержании 10 мг/кг и выше разница между результатами двух параллельных определений, проведенных на одной и той же пробе, не должна превышать 15 % относительно более высокого результата.

7.3. Восстановление.

Для обогащенной (холостой) пробы извлечение должно составлять не менее 90 %.

8. Результаты совместного исследования

Было организовано совместное исследование, в ходе которого восемь лабораторий проанализировали шесть кормов, четыре премикса и три препарата. Для каждого образца были проведены повторные анализы. (Более подробную информацию об этом совместном исследовании можно найти в Журнале AOAC, том 71, 1988 г., стр. 484-490). Результаты (исключая выбросы) показаны ниже: L: количество лабораторий.

n: количество одиночных значений.

sr: стандартное отклонение повторяемости.

CVr: коэффициент вариации повторяемости.

SR: стандартное отклонение воспроизводимости.

CVR: коэффициент вариации воспроизводимости.

>ТАБЛИЦА>

>ТАБЛИЦА>