Директива Комиссии 2000/32/EC от 19 мая 2000 г. об адаптации к техническому прогрессу в 26-й раз. Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ (Текст имеющих отношение к ЕЭЗ.)

Директива Комиссии 2000/32/EC

от 19 мая 2000 г.

адаптация к техническому прогрессу в 26-й раз Директива Совета 67/548/EEC о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ(1)

(Текст, имеющий отношение к ЕЭЗ)

КОМИССИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СООБЩЕСТВ,

Принимая во внимание Договор о создании Европейского сообщества,

Принимая во внимание Директиву Совета 67/548/EEC от 27 июня 1967 г. о сближении законов, правил и административных положений, касающихся классификации, упаковки и маркировки опасных веществ(2), с последними поправками, внесенными Директивой Европейского Парламента и Совета 1999 г. /33/EC(3) и, в частности, его статья 28,

Тогда как:

(1) Приложение I к Директиве 67/548/EEC содержит список опасных веществ, а также сведения о классификации и маркировке каждого вещества. Современные научные и технические знания показали, что список опасных веществ в этом Приложении следует адаптировать. Некоторые языковые версии Директивы требуют исправлений в определенных разделах предисловия и Таблицы А Приложения I.

(2) Приложение III к Директиве 67/548/EEC содержит список фраз, указывающих на характер особых рисков, связанных с опасными веществами и препаратами. Приложение IV к Директиве 67/548/EEC содержит список фраз, обозначающих рекомендации по безопасности в отношении опасных веществ и препаратов. Приложение VI к Директиве 67/548/EEC содержит руководство по классификации и маркировке опасных веществ и препаратов. Некоторые языковые версии Директивы требуют исправлений в отдельных разделах Приложений III, IV и VI.

(3) Приложение V к Директиве 67/548/EEC устанавливает методы определения физико-химических свойств, токсичности и экотоксичности веществ и препаратов. Необходимо адаптировать это Приложение к техническому прогрессу.

(4) Приложение IX к Директиве 67/548/EEC содержит положения, касающиеся креплений, защищенных от детей. Эти положения следует адаптировать и обновить. Необходимо расширить сферу использования креплений с защитой от детей.

(5) Меры, предусмотренные настоящей Директивой, соответствуют мнению Комитета по адаптации к техническому прогрессу Директив по устранению технических барьеров в торговле опасными веществами и препаратами,

ПРИНЯЛ НАСТОЯЩУЮ ДИРЕКТИВУ:

Статья 1

В Директиву 67/548/EEC настоящим вносятся следующие поправки:

1. В Приложение I вносятся следующие изменения:

(a) Примечание Q в Приложении 1А к настоящей Директиве заменяет соответствующее примечание в Предисловии.

(b) Строки в Приложении 1В к настоящей Директиве заменяют соответствующие строки в Таблице А.

(c) Записи в Приложении 1C к настоящей Директиве заменяют соответствующие записи.

(d) Вставляются записи в Приложении 1D к настоящей Директиве.

2. Фраза о риске в Приложении 2 к настоящей Директиве заменяет соответствующую фразу в Приложении III.

3. В Приложение IV вносятся следующие поправки:

(a) Фразы безопасности в Приложении 3А к настоящей Директиве заменяют соответствующие фразы в Приложении IV.

(b) Комбинированные фразы безопасности в Приложении 3B к настоящей Директиве заменяют соответствующие фразы в Приложении IV.

4. В Часть Б Приложения V вносятся следующие изменения:

(a) Текст Приложения 4А к настоящей Директиве заменяет главу B.10.

(b) Текст Приложения 4B к настоящей Директиве заменяет главу B.11.

(c) Текст Приложения 4C к настоящей Директиве заменяет Главу B.12.

(d) Текст Приложения 4D к настоящей Директиве заменяет Главы B.13 и B.14.

(e) Текст Приложения 4E к настоящей Директиве заменяет главу B.17.

(f) Текст Приложения 4F к настоящей Директиве заменяет Главу B.23. Соответственно изменено название главы Б.23 в пояснительной записке.

(g) Добавлен текст в Приложении 4G к настоящей Директиве.

5. Четвертый абзац общего введения к Части C Приложения V удален.

6. Тексты Приложения 5 к настоящей Директиве заменяют соответствующие тексты Приложения VI.

7. В Приложение IX вносятся поправки, указанные в Приложении 6 к настоящей Директиве.

Статья 2

1. Государства-члены должны ввести в действие законы, нормативные акты и административные положения, необходимые для соблюдения настоящей Директивы, не позднее 1 июня 2001 г. Они должны немедленно проинформировать об этом Комиссию.

Когда государства-члены ЕС принимают эти положения, они должны содержать ссылку на настоящую Директиву или сопровождаться такой ссылкой в ​​случае их официальной публикации. Государства-члены ЕС должны определить, как следует делать такую ​​ссылку.

2. Государства-члены должны сообщить Комиссии основные положения национального законодательства, которые они принимают в области, охватываемой настоящей Директивой, а также таблицу корреляции между настоящей Директивой и принятыми национальными положениями.

Статья 3

Настоящая Директива вступает в силу на третий день после ее публикации в Официальном журнале Европейских сообществ.

Статья 4

Данная Директива адресована государствам-членам.

Совершено в Брюсселе 19 мая 2000 года.

Для Комиссии

Марго Вальстрём

Член Комиссии

(1) Принято после 27-й адаптации.

(2) ОЖ 196, 16 августа 1967 г., с. 1.

(3) OJ L 199, 30 июля 1999 г., с. 57.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1А

ПРЕДИСЛОВИЕ К ПРИЛОЖЕНИЮ I

Пояснения к примечаниям, касающимся идентификации, классификации и маркировки веществ

И:

Примечание Вопрос:

Классификация канцерогенных веществ может быть исключена для волокон, отвечающих одному из следующих условий:

- кратковременный тест на биоперсистенцию при вдыхании показал, что волокна длиной более 20 мкм имеют взвешенный период полураспада менее 10 дней.

- кратковременный тест на биоперсистенцию путем интратрахеальной инстилляции показал, что волокна длиной более 20 мкм имеют взвешенный период полураспада менее 40 дней.

- подходящий внутрибрюшинный образец не показал канцерогенного эффекта, или

- соответствующий долгосрочный ингаляционный тест не выявил значимых патогенных эффектов или неопластических изменений.

СВ:

Примечание Вопрос:

Вещество не обязательно классифицируется как канцерогенное, если можно доказать, что оно удовлетворяет одному из следующих условий:

- краткосрочный тест для определения биологической стойкости при вдыхании показал, что волокна длиной более 20 мкм имеют взвешенный период полураспада менее 10 дней.

- краткосрочный тест для определения биологической стойкости путем интратрахеальной инстилляции показал, что волокна длиной более 20 мкм имеют взвешенный период полураспада менее 40 дней.

- соответствующий внутрибрюшинный тест не предоставил доказательств повышенной канцерогенности

- отсутствие значимой патогенности или неопластических изменений при соответствующем длительном ингаляционном тесте.

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

ПРИЛОЖЕНИЕ 1Б

«ТАБЛИЦА А

>ТАБЛИЦА>"

ПРИЛОЖЕНИЕ 1С

>ТАБЛИЦА>

ПРИЛОЖЕНИЕ 1D

>ТАБЛИЦА>

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

66 рэндов

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

ПРИЛОЖЕНИЕ 3А

С 23

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

С 26

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

С 56

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии EL)

(Не относится к версии FR)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

ПРИЛОЖЕНИЕ 3Б

С 27/28

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

С 29/56

>ТАБЛИЦА>

(Не касается версии DA)

(Не касается версии EL)

(Не относится к версии FR)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

ПРИЛОЖЕНИЕ 4А

«B.10. МУТАГЕННОСТЬ – ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУЮ АБЕРРАЦИЮ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VITRO

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 473, Тест на хромосомные аберрации млекопитающих in vitro (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью теста на хромосомные аберрации in vitro является выявление агентов, вызывающих структурные хромосомные аберрации в культивируемых клетках млекопитающих (1) (2) (3). Структурные аберрации могут быть двух типов: хромомные и хроматидные. У большинства химических мутагенов индуцируются аберрации хроматидного типа, но встречаются и аберрации хромосомного типа. Увеличение полиплоидии может указывать на то, что химическое вещество может вызывать числовые аберрации. Однако этот метод не предназначен для измерения числовых аберраций и обычно не используется для этой цели. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной многих генетических заболеваний человека, и существуют убедительные доказательства того, что хромосомные мутации и связанные с ними события, вызывающие изменения в онкогенах и генах-супрессорах опухолей соматических клеток, участвуют в индукции рака у людей и экспериментальных животных.

В тесте на хромосомную аберрацию in vitro можно использовать культуры установленных клеточных линий, клеточных штаммов или первичных клеточных культур. Используемые клетки отбираются на основе способности к росту в культуре, стабильности кариотипа, числа хромосом, разнообразия хромосом и частоты спонтанных хромосомных аберраций.

Тесты, проводимые in vitro, обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации. Эта система метаболической активации не может полностью имитировать условия in vivo млекопитающих. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать условий, которые могут привести к положительным результатам, которые не отражают внутреннюю мутагенность и могут возникнуть в результате изменений pH, осмоляльности или высокого уровня цитотоксичности (4) (5).

Этот тест используется для выявления возможных мутагенов и канцерогенов млекопитающих. Многие соединения, показавшие положительный результат в этом тесте, являются канцерогенами для млекопитающих; однако не существует идеальной корреляции между этим тестом и канцерогенностью. Корреляция зависит от химического класса, и появляется все больше свидетельств того, что существуют канцерогены, которые не обнаруживаются с помощью этого теста, поскольку они, по-видимому, действуют через механизмы, отличные от прямого повреждения ДНК.

См. также «Общее введение», часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Аберрация хроматидного типа: структурное повреждение хромосом, выражающееся в разрыве одиночных хроматид или разрыве и воссоединении хроматид.

Аберрация хроматидного типа: структурное повреждение хромосом, выражающееся в разрыве или разрыве и воссоединении обеих хроматид в одном и том же месте.

Эндоредупликация: процесс, при котором после S-периода репликации ДНК ядро ​​не переходит в митоз, а начинает новый S-период. В результате получаются хромосомы с 4, 8, 16,... хроматидами.

Разрыв: ахроматическое поражение меньше ширины одной хроматиды и с минимальным смещением кроматид.

Митотический индекс: соотношение клеток в метафазе, деленное на общее количество клеток, наблюдаемых в популяции клеток; показатель степени распространения этой популяции.

Числовая аберрация: изменение числа хромосом по сравнению с нормальным числом, характерным для используемых клеток.

Полиплоидия: число гаплоидных хромосом (n), кратное диплоидному числу (т. е. 3n, 4n и т. д.).

Структурная аберрация: изменение структуры хромосом, выявляемое при микроскопическом исследовании метафазной стадии деления клеток, наблюдаемое в виде делеций и фрагментов, внутризамен или обменов.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Культуры клеток подвергают воздействию тестируемого вещества как с метаболической активацией, так и без нее. Через заранее определенные промежутки времени после воздействия тестируемого вещества на культуры клеток их обрабатывают веществом, задерживающим метафазу (например, Колцемид® или колхицин), собирают, окрашивают и метафазные клетки анализируют микроскопически на наличие хромосомных аберраций.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Клетки

Можно использовать различные клеточные линии, штаммы или первичные культуры клеток, включая клетки человека (например, фибробласты китайского хомячка, лимфоциты периферической крови человека или других млекопитающих).

1.4.1.2. Медиа и культурные условия

Для поддержания культур следует использовать соответствующие культуральные среды и условия инкубации (культиваторы, концентрация CO2, температура и влажность). Установленные клеточные линии и штаммы следует регулярно проверять на стабильность модального числа хромосом и отсутствие контаминации микоплазмой. использовать в случае загрязнения. Должно быть известно нормальное время клеточного цикла для используемых клеток и условий культивирования.

1.4.1.3. Подготовка культур

Установленные клеточные линии и штаммы: клетки размножают из исходных культур, высеивают в культуральную среду с такой плотностью, чтобы культуры не достигли слияния до момента сбора, и инкубируют при 37 °C.

Лимфоциты: цельную кровь, обработанную антикоагулянтом (например, гепарином), или выделенные лимфоциты, полученные от здоровых людей, добавляют в культуральную среду, содержащую митоген (например, фитогемагглютинин), и инкубируют при 37 °C.

1.4.1.4. Метаболическая активация

Клетки должны подвергаться воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора (S9), полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты, такими как Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), или смесью фенобарбитон и β-нафтофлавон (10) (11) (12).

Постмитохондриальную фракцию обычно используют в концентрациях в диапазоне 1-10% об./об. в конечной тестируемой среде. Состояние системы метаболической активации может зависеть от класса тестируемого химического вещества. В некоторых случаях может оказаться целесообразным использовать более одной концентрации постмитохондриальной фракции.

Ряд разработок, включая создание генетически модифицированных клеточных линий, экспрессирующих специфические активирующие ферменты, могут обеспечить потенциал эндогенной активации. Выбор используемых клеточных линий должен быть научно обоснован (например, значимостью изофермента цитохрома Р450 для метаболизма тестируемого вещества).

1.4.1.5. Испытуемое вещество/препарат

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед обработкой клеток. Жидкие тестовые вещества можно добавлять непосредственно в тест-системы и/или разбавлять перед обработкой. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом и должен быть совместим с выживанием клеток и активностью S9. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подтверждено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя. При испытании неустойчивых к воде веществ используемые органические растворители не должны содержать воды. Воду можно удалить, добавив молекулярное сито.

1.4.2.2. Концентрации воздействия

Среди критериев, которые следует учитывать при определении наивысшей концентрации, — цитотоксичность, растворимость в тест-системе и изменения pH или осмоляльности.

Цитотоксичность следует определять с метаболической активацией и без нее в основном эксперименте, используя соответствующие показатели целостности и роста клеток, такие как степень слияния, количество жизнеспособных клеток или митотический индекс. Может быть полезно определить цитотоксичность и растворимость в предварительном эксперименте.

Следует использовать как минимум три анализируемые концентрации. В случае возникновения цитотоксичности эти концентрации должны охватывать диапазон от максимальной до незначительной токсичности или отсутствия токсичности; обычно это означает, что концентрации должны различаться не более чем на коэффициент от 2 до [радик]10. Во время сбора самая высокая концентрация должна демонстрировать значительное снижение степени слияния, количества клеток или митотического индекса (все более 50%). Митотический индекс является лишь косвенным показателем цитотоксического/цитостатического действия и зависит от времени после лечения. Однако митотический индекс приемлем для суспензионных культур, в которых другие измерения токсичности могут быть громоздкими и непрактичными. Информация о кинетике клеточного цикла, такая как среднее время генерации (AGT), может быть использована в качестве дополнительной информации. Однако AGT представляет собой общее среднее значение, которое не всегда указывает на существование отсроченных субпопуляций, и даже небольшое увеличение среднего времени генерации может быть использовано в качестве дополнительной информации. связано с весьма существенной задержкой момента оптимального выхода аберраций.

Для относительно нецитотоксичных веществ максимальная тестируемая концентрация должна составлять 5 мкл/мл, 5 мг/мл или 0,01 М, в зависимости от того, что является наименьшим.

Для относительно нерастворимых веществ, которые не токсичны при концентрациях ниже нерастворимых, наибольшая используемая доза должна составлять концентрацию, превышающую предел растворимости в конечной культуральной среде в конце периода лечения. В некоторых случаях (например, когда токсичность проявляется только при концентрации, превышающей самую низкую нерастворимую) рекомендуется проводить испытания при более чем одной концентрации с видимым осадком. Может оказаться полезным оценить растворимость в начале и в конце лечения, поскольку растворимость может меняться в ходе воздействия тест-системы из-за присутствия клеток, сыворотки S9 и т. д. Нерастворимость можно обнаружить невооруженным глазом. . Осадок не должен мешать подсчету очков.

1.4.2.3. Отрицательный и положительный контроль

В каждый эксперимент следует включать одновременные положительные и отрицательные контроли (растворитель или носитель), как с метаболической активацией, так и без нее. При использовании метаболической активации химическое вещество положительного контроля должно быть тем, которое требует активации для получения мутагенного ответа.

В положительном контроле следует использовать известный эластоген при уровнях воздействия, которые, как ожидается, дадут воспроизводимое и обнаруживаемое увеличение по сравнению с фоном, что демонстрирует чувствительность тест-системы.

Концентрации положительного контроля следует выбирать так, чтобы эффекты были очевидны, но не раскрывали сразу читателю идентичность закодированных слайдов. Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Могут быть использованы другие соответствующие вещества положительного контроля. Следует рассмотреть возможность использования химических веществ положительного контроля, соответствующих химическому классу, если таковые имеются.

Отрицательные контроли, состоящие только из растворителя или носителя в обрабатывающей среде и обработанные так же, как и обрабатывающие культуры, должны быть включены для каждого времени сбора урожая. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, если нет исторических данных по контролю, демонстрирующих, что выбранный растворитель не вызывает никаких вредных или мутагенных эффектов.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Лечение тестируемым веществом

Пролиферирующие клетки обрабатывают тестируемым веществом при наличии и отсутствии системы метаболической активации. Лечение лимфоцитов следует начинать примерно через 48 часов после митогенной стимуляции.

1.4.3.2. Дубликаты культур обычно следует использовать при каждой концентрации, и настоятельно рекомендуется использовать их для отрицательных культур/культур с растворителем. Если на основе исторических данных можно продемонстрировать минимальные различия между дубликатами культур (13) (14), может быть приемлемо использование отдельных культур в каждой концентрации.

Газообразные или летучие вещества следует проверять соответствующими методами, например, в герметичных культуральных сосудах (15) (16).

1.4.3.3. Время сбора урожая культуры

В первом эксперименте клетки должны подвергаться воздействию тестируемого вещества, как с метаболической активацией, так и без нее, в течение 3-6 часов и отбираться пробы за время, эквивалентное примерно 1,5 нормальной продолжительности клеточного цикла после начала лечения (12). . Если этот протокол дает отрицательные результаты как с активацией, так и без нее, следует провести дополнительный эксперимент без активации с непрерывным лечением до отбора проб во время, эквивалентное примерно 1,5 нормальной продолжительности клеточного цикла. Определенные химические вещества легче обнаружить, если время обработки/отбора проб превышает 1,5 цикла. Отрицательные результаты метаболической активации необходимо согласовывать в каждом конкретном случае. В тех случаях, когда подтверждение отрицательных результатов не считается необходимым, должно быть предоставлено обоснование.

1.4.3.4. Подготовка хромосом

Культуры клеток обрабатывают Колцемидом® или колхицином обычно за 1-3 часа до сбора. Каждую клеточную культуру собирают и обрабатывают отдельно для получения хромосом. Подготовка хромосом включает гипотоническую обработку клеток, фиксацию и окрашивание.

1.4.3.5. Анализ

Все предметные стекла, включая положительные и отрицательные контроли, перед микроскопическим анализом должны быть независимо закодированы. Поскольку процедуры фиксации часто приводят к разрыву части метафазных клеток с потерей хромосом, оцениваемые клетки должны, следовательно, содержать количество центромер, равное модальному числу [ne] 2 для всех типов клеток. По меньшей мере, 200 хорошо распределенных метафаз должны быть оценены на каждую концентрацию и контроль, поровну разделены между дубликатами, если применимо. Это число можно уменьшить, если наблюдается большое количество аберраций.

Хотя целью теста является обнаружение структурных хромосомных аберраций, важно регистрировать полиплоидию и эндоредупликацию, когда эти события наблюдаются.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Экспериментальной единицей является клетка, поэтому следует оценить процент клеток со структурными хромосомными аберрациями. Следует перечислить различные типы структурных хромосомных аберраций с указанием их количества и частоты для экспериментальных и контрольных культур. Пропуски регистрируются отдельно и сообщаются, но обычно не включаются в общую частоту аберраций.

Также следует регистрировать одновременные измерения цитотоксичности для всех обработанных и отрицательных контрольных культур в основных экспериментах по выявлению аберраций.

Должны быть предоставлены индивидуальные данные по культуре. Кроме того, все данные должны быть сведены в табличную форму.

Нет необходимости проверять четкий положительный ответ. Сомнительные результаты следует уточнять путем дальнейшего тестирования, желательно с модификацией условий эксперимента. Необходимость подтверждения отрицательных результатов обсуждалась в 1.4.3.3. Модификацию параметров исследования для расширения диапазона оцениваемых условий следует учитывать в последующих экспериментах. Параметры исследования, которые могут быть изменены, включают интервал концентраций и условия метаболической активации.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев определения положительного результата, таких как концентрационное увеличение или воспроизводимое увеличение количества клеток с хромосомными аберрациями. В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний (3) (13). Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа.

Увеличение количества полиплоидных клеток может указывать на то, что тестируемое вещество обладает потенциалом ингибировать митотические процессы и вызывать числовые хромосомные аберрации. Увеличение числа клеток с эндоредуплицированными хромосомами может указывать на то, что тестируемое вещество потенциально способно ингибировать развитие клеточного цикла (17) (18).

Тестируемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этой системе.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительные результаты теста на хромосомные аберрации in vitro указывают на то, что тестируемое вещество индуцирует структурные хромосомные аберрации в культивируемых соматических клетках млекопитающих. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытаний испытуемое вещество не вызывает хромосомных аберраций в культивируемых соматических клетках млекопитающих.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Растворитель/носитель:

- обоснование выбора транспортного средства,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Ячейки:

- тип и источник клеток,

- особенности кариотипа и пригодность используемого типа клеток,

- отсутствие микоплазмы, если применимо,

- информация о длине клеточного цикла,

- пол доноров крови, цельная кровь или сепарированные лимфоциты, использованный митоген,

- количество проходов, если применимо,

- методы поддержания культуры клеток, если применимо,

- модальное число хромосом.

Условия испытаний:

- личность вещества, задерживающего метафазу, его концентрация и продолжительность воздействия на клетки,

- обоснование выбора концентраций и количества культур, включая, например, данные о цитотоксичности и ограничениях растворимости, если таковые имеются,

- состав среды, концентрация CO2, если применимо,

- концентрация испытуемого вещества,

- добавленный объем растворителя и испытуемого вещества,

- температура инкубации,

- время инкубации,

- продолжительность лечения,

- плотность клеток при посеве, если необходимо,

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости,

- положительный и отрицательный контроль,

- методы подготовки слайдов,

- критерии оценки аберраций,

- количество проанализированных метафаз,

- методы измерения токсичности,

- критерии признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными,

Полученные результаты:

- признаки токсичности, например. степень слияния, данные клеточного цикла, количество клеток, митотический индекс,

- признаки осадков,

- данные о pH и осмоляльности обрабатывающей среды, если они определены,

- определение аберраций, включая пробелы,

- количество клеток с хромосомными аберрациями и тип хромосомных аберраций, приведенные отдельно для каждой обработанной и контрольной культуры,

- изменения плоидности, если они наблюдаются,

- взаимосвязь «доза-реакция», где это возможно,

- статистический анализ, если таковой имеется,

- одновременные отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные,

- исторические отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Эванс, Х.Дж. (1976), Цитологические методы обнаружения химических мутагенов, в: Химические мутагены, принципы и методы их обнаружения, Vol. 4, Холлаендер, А. (редактор) Plenum Press, Нью-Йорк и Лондон, стр. 1–29.

(2) Исидате М. младший и Софуми Т. (1985), Тест на хромосомные аберрации in vitro с использованием фибробластов легких китайского хомячка (CHL) в культуре, в: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Эшби Дж. и др., (ред.) Elsevier Science Publishers, Амстердам-Нью-Йорк-Оксфорд, стр. 427-432.

(3) Галлоуэй, С.М., Армстронг, М.Дж., Рубен, К., Колман, С., Браун, Б., Кэннон, К., Блум, А.Д., Накамура, Ф., Ахмед, М., Дук, С., Римпо Дж., Марголин Г.Х., Резник М.А., Андерсон Г. и Зейгер Э. (1978), Хромосомные аберрации и сестринские хроматические обмены в клетках яичника китайского хомячка: Оценка 108 химических веществ, Environs, Molec. Мутаген 10 (приложение 10), стр. 1–175.

(4) Скотт Д., Галлоуэй С.М., Маршалл Р.Р., Ишидате М.младший, Брусик Д., Эшби Дж. и Мир Б.К. (1991), Генотоксичность в экстремальных условиях культивирования. Отчет целевой группы 9 ICPEMC, Mutation Res., 257, стр. 147-204.

(5) Морита Т., Т. Нагаки, И. Фукуда и К. Окумура (1992), Кластогенность низкого pH для различных культивируемых клеток млекопитающих, Mutation Res., 268, стр. 100-111. 297-3

(6) Эймс Б.Н., Макканн Дж. и Ямасаки Э. (1975), Методы обнаружения канцерогенов и мутагенов с помощью теста на мутагенность микросом сальмонеллы/млекопитающих, Mutation Res., 31, стр. 347-364.

(7) Марон Д.М. и Эймс Б.Н. (1983), Пересмотренные методы теста на мутагенность сальмонелл, Mutation Res., 113, стр. 173-215.

(8) Натараджан А.Т., Тейтс А.Д., ван Буул П.П.В., Мейерс М. и де Фогель Н. (1976), Цитогенетические эффекты мутагенов/канцерогенов после активации в микросомальной системе in vitro, I. Индукция хромосомы Аберрации и обмен сестринских хроматид под действием диэтилнитрозамина (DEN) и диметилнитрозамина (DMN) в клетках CHO в присутствии микросом печени крысы, Mutation Res., 37, стр. 83-90.

(9) Мацуока А., Хаяси М. и Исидате М. младший (1979), Тесты на хромосомные аберрации 29 химических веществ в сочетании со смесью S9 in vitro, Mutation Res., 66, стр. 277-290.

(10) Эллиот, Б.М., Комбс, Р.Д., Элкомб, К.Р., Гейтхаус, Д.Г., Гибсон, Г.Г., Маккей, Дж.М. и Вольф, Р.К. (1992), Отчет Рабочей группы Британского общества по экологическим мутагенам. Альтернатива S9, индуцированному Aroclor 1254, в анализах генотоксичности in vitro, Mutagenesis, 7, стр. 175-177.

(11) Мацушима Т., Савамура М., Хара К. и Сугимура Т. (1976), А. Безопасный заменитель полихлорированных дифенилов как индуктор систем метаболической активации, в: де Серрес, Ф.Дж. Фаутс, Дж.Р. Бенд Дж. Р. и Филпот Р. М. (редакторы), Метаболическая активация in vitro при тестировании мутагенеза, Elsevier, Северная Голландия, стр. 85-88.

(12) Галлоуэй, С.М., Аардема, М.Дж., Ишидате, М.младший, Иветт, Дж.Л., Киркланд, Д.Дж. Морита, Т., Мозессо, П., Софуми, Т. (1994). Тесты in vitro на хромосомные аберрации, Mutation Res., 312, стр. 107-111. 241-2

(13) Ричардсон К., Уильямс Д.А., Аллен Дж.А., Амфлетт Г., Чантер Д.О. и Филлипс Б. (1989), Анализ данных цитогенетических анализов in vitro, в: Статистическая оценка данных испытаний на мутагенность. , Киркланд, Д.Дж., (cd) Издательство Кембриджского университета, Кембридж, стр. 141–154.

(14) Сопер, К.А. и Галлоуэй, С.М. (1994), Реплицирующие колбы не нужны для анализа хромосомных аберраций in vitro в клетках CHO, Mutation Res., 312, стр. 139-149.

(15) Кран Д.Ф., Барски Ф.К. и МакКуи К.Т. (1982), Анализ мутации CHO/HGPRT: оценка газов и летучих жидкостей, в: Тайс Р.Р., Коста Д.Л., Шайх К.М. (ред.), Генотоксические эффекты агентов воздушно-десантных войск, Нью-Йорк, Пленум, стр. 91–103.

(16) Самора, П.О., Бенсон, Дж.М., Ли, А.П. и Брукс, А.Л. (1983), Оценка системы воздействия с использованием клеток, выращенных на коллагеновых гелях, для обнаружения высоколетучих мутагенов в анализе мутаций CHO/HGPRT, Экологический мутагенез, 5 , стр. 795-801.

(17) Локк-Хюле, К. (1983), Эндоредупликация в клетках китайского хомячка во время ареста G2, индуцированного альфа-излучением, Mutation Res., 119, стр. 403-413.

(18) Хуанг Ю., Чейндж К. и Троско Дж. Э. (1983), Афидиколин-индуцированная эндоредупликация в клетках китайского хомячка, Cancer Res., 43, стр. 1362-1364».

ПРИЛОЖЕНИЕ 4Б

«B.11. МУТАГЕННОСТЬ – ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУЮ АБЕРРАЦИЮ В КОСТНОМ МОЗГЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 475, Тест на хромосомные аберрации костного мозга млекопитающих (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Тест на хромосомные аберрации млекопитающих in vivo используется для обнаружения структурных хромосомных аберраций, вызванных тестируемым веществом в клетках костного мозга животных, обычно грызунов (1) (2) (3) (4). Структурные хромосомные аберрации могут быть двух типов: хромосомные и хроматидные. Увеличение полиплоидии может указывать на то, что химическое вещество может вызывать числовые аберрации. У большинства химических мутагенов индуцируются аберрации хроматидного типа, но встречаются и аберрации хромосомного типа. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной генетических заболеваний человека, и существуют убедительные доказательства того, что хромосомные мутации и связанные с ними события, вызывающие изменения в онкогенах и генах-супрессорах опухолей, участвуют в развитии рака у людей и экспериментальных систем.

В этом тесте обычно используются грызуны. Костный мозг является целевой тканью в этом тесте, поскольку он представляет собой ткань с высокой васкуляризацией и содержит популяцию быстро циклических клеток, которые можно легко выделить и обработать. Другие виды и ткани-мишени не являются предметом данного метода.

Этот тест на хромосомные аберрации особенно важен для оценки мутагенной опасности, поскольку он позволяет учитывать факторы метаболизма, фармакокинетики и процессов восстановления ДНК in vivo, хотя они могут варьироваться в зависимости от вида и ткани. Тест in vivo также полезен для дальнейшего изучения мутагенного эффекта, обнаруженного с помощью теста in vitro.

Если есть свидетельства того, что тестируемое вещество или реактивный метаболит не достигнет ткани-мишени, использовать этот тест нецелесообразно.

См. также Общее введение, часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Аберрация хроматидного типа: структурное повреждение хромосом, выражающееся в разрыве одиночных хроматид или разрыве и воссоединении хроматид.

Аберрация хромосомного типа: структурное повреждение хромосомы, выражающееся в разрыве или разрыве и воссоединении обеих хроматид в одном и том же месте.

Эндоредупликация: процесс, при котором после S-периода репликации ДНК ядро ​​не переходит в митоз, а начинает новый S-период. В результате получаются хромосомы с 4, 8, 16,... хроматидами.

Разрыв: ахроматическое поражение размером меньше ширины одной хроматиды и с минимальным смещением хроматид(ов).

Числовая аберрация: изменение числа хромосом по сравнению с нормальным числом, характерным для используемых клеток.

Полиплоидия: число гаплоидных хромосом (n), кратное диплоидному числу (т. е. 3n, 4n и т. д.).

Структурная аберрация: изменение структуры хромосом, выявляемое при микроскопическом исследовании метафазной стадии деления клеток, наблюдаемое в виде делеций и фрагментов, внутризамен или обменов.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Животных подвергают воздействию тестируемого вещества подходящим путем и умерщвляют в соответствующее время после лечения. Перед умерщвлением животных обрабатывают агентом, задерживающим метафазу (например, колхицином или Колцемидом®). Затем из клеток костного мозга готовят и окрашивают хромосомные препараты, а метафазные клетки анализируют на наличие хромосомных аберраций.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Выбор вида животных

Обычно используются крысы, мыши и китайские хомяки, хотя можно использовать любые подходящие виды млекопитающих. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых взрослых животных. В начале исследования вариация массы животных должна быть минимальной и не превышать ±20 % средней массы каждого пола.

1.4.1.2. Условия содержания и кормления

Применяются общие условия, указанные в Общем введении к Части B, хотя целевая влажность должна составлять 50–60 %.

1.4.1.3. Подготовка животных

Здоровые молодые взрослые животные случайным образом распределяются в контрольную и экспериментальную группы. Клетки должны быть расположены таким образом, чтобы возможные последствия их размещения были сведены к минимуму. Животные идентифицируются однозначно. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям не менее пяти дней.

1.4.1.4. Приготовление доз

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед введением животным. Жидкие тестируемые вещества можно дозировать непосредственно или разбавлять перед дозированием. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен оказывать токсического воздействия при используемых дозах и не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подкреплено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя.

1.4.2.2. Элементы управления

В каждом тесте для каждого пола должны быть включены одновременные положительные и отрицательные контроли (растворитель/носитель). За исключением обработки тестируемым веществом, с животными в контрольных группах следует обращаться так же, как с животными в обработанных группах.

Положительный контроль должен вызывать структурные отклонения in vivo при уровнях воздействия, которые, как ожидается, будут давать заметное увеличение по сравнению с фоном. Положительные контрольные дозы следует выбирать так, чтобы эффект был очевиден, но не раскрывал сразу читателю идентичность закодированных слайдов. Допустимо, чтобы положительный контроль вводился способом, отличным от испытуемого вещества, и пробы отбирались только один раз. Если таковые имеются, можно рассмотреть возможность использования химикатов положительного контроля соответствующего химического класса. Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Отрицательные контроли, обработанные только растворителем или наполнителем и в остальном обработанные так же, как и группы лечения, должны быть включены для каждого времени отбора проб, если только на основе исторических данных контроля не доступны приемлемые межживотные изменчивость и частота клеток с хромосомными аберрациями. Если для отрицательного контроля применяется однократный отбор проб, наиболее подходящим временем является время первого отбора проб. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, если только нет исторических или опубликованных данных по контролю, демонстрирующих, что выбранный растворитель/носитель не вызывает никаких вредных мутагенных эффектов.

1,5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Количество и пол животных

Каждая обработанная и контрольная группы включают по меньшей мере пять поддающихся анализу животных каждого пола. Если на момент проведения исследования имеются данные исследований на одном и том же виде и с использованием одного и того же пути воздействия, которые демонстрируют отсутствие существенных различий в токсичности между полами, то тестирования на одном поле будет достаточно. Если воздействие химических веществ на человека может зависеть от пола, как, например, в случае с некоторыми фармацевтическими агентами, испытания следует проводить на животных соответствующего пола.

1.5.2. График лечения

Тестируемые вещества предпочтительно вводятся в виде однократного лечения. Тестируемые вещества также можно вводить в виде разделенной дозы, т.е. две обработки в один и тот же день с интервалом не более нескольких часов, чтобы облегчить введение большого объема материала. Другие режимы дозирования должны быть научно обоснованы.

Образцы следует брать два раза в один день после лечения. Для грызунов первый интервал отбора проб составляет 1,5 нормальной продолжительности клеточного цикла (последний обычно составляет 12-18 часов) после обработки. Поскольку время, необходимое для поглощения и метаболизма тестируемого вещества, а также его влияние на кинетику клеточного цикла, может повлиять на оптимальное время обнаружения хромосомных аберраций, рекомендуется более поздний отбор проб через 24 часа после первого отбора проб. Если используются схемы дозирования более одного дня, следует использовать один раз для отбора проб при 1,5 нормальных длинах клеточного цикла после окончательного лечения.

Перед умерщвлением животным внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу агента, задерживающего метафазу (например, Колцемид® или колхицин). После этого через соответствующие промежутки времени у животных отбирают образцы. Для мышей этот интервал составляет примерно 3–5 часов; для китайских хомяков этот интервал составляет примерно 4-5 часов. Клетки собирают из костного мозга и анализируют на наличие хромосомных аберраций.

1.5.3. Уровни доз

Если исследование по определению диапазона проводится из-за отсутствия подходящих данных, его следует проводить в той же лаборатории с использованием того же вида, штамма, пола и схемы лечения, которые использовались в основном исследовании (5). Если имеется токсичность, для первого отбора проб используются три уровня дозы. Эти уровни доз должны охватывать диапазон от максимальной до незначительной токсичности или отсутствия токсичности. В более позднее время отбора проб необходимо использовать только самую высокую дозу. Наивысшая доза определяется как вызывающие дозу признаки токсичности, при которых можно ожидать, что более высокие уровни дозы, основанные на том же режиме дозирования, приведут к летальному исходу. Вещества со специфической биологической активностью в низких нетоксичных дозах (например, гормоны и митогены) могут быть исключениями из критериев установления дозы и должны оцениваться в каждом конкретном случае. Высшую дозу можно также определить как дозу, которая вызывает некоторые признаки токсичности в костном мозге (например, снижение митотического индекса более чем на 50%).

1.5.4. Предельный тест

Если тест с одной дозой не менее 2000 мг/кг массы тела с использованием однократного лечения или двух обработок в один и тот же день не дает наблюдаемых токсических эффектов и если на основании данных о структурно родственных веществах не ожидается генотоксичности , то полное исследование с использованием трех уровней доз может не считаться необходимым. Для исследований более длительной продолжительности предельная доза составляет 2000 мг/кг/массу тела/день для лечения длительностью до 14 дней и 1000 мг/кг/массу тела/день для лечения более 14 дней. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня дозы в предельном испытании.

1.5.5. Введение доз

Тестируемое вещество обычно вводят через зонд с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли или путем внутрибрюшинной инъекции. Другие пути воздействия могут быть приемлемыми, если они оправданы. Максимальный объем жидкости, который можно вводить через зонд или путем инъекции за один раз, зависит от размера подопытного животного. Объем не должен превышать 2 мл/100 г массы тела. Использование объемов, превышающих эти, должно быть обосновано. За исключением раздражающих или разъедающих веществ, действие которых обычно усиливается при более высоких концентрациях, изменчивость испытательного объема следует свести к минимуму путем корректировки концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.5.6. Подготовка хромосом

Сразу после умерщвления извлекают костный мозг, подвергают воздействию гипотонического раствора и фиксируют. Затем клетки распределяют по предметным стеклам и окрашивают.

1.5.7. Анализ

Митотический индекс следует определять как меру цитотоксичности по меньшей мере в 1000 клеток на животное для всех обработанных животных (включая положительный контроль) и необработанных животных отрицательного контроля.

Для каждого животного следует анализировать не менее 100 клеток. Это число можно уменьшить, если наблюдается большое количество аберраций. Все предметные стекла, включая положительные и отрицательные контроли, перед микроскопическим анализом должны быть независимо закодированы. Поскольку процедуры подготовки предметных стекол часто приводят к разрыву части метафаз с потерей хромосом, поэтому оцениваемые клетки должны содержать количество центромер, равное числу 2n ± 2.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные по отдельным животным должны быть представлены в табличной форме. Экспериментальная единица – животное. Для каждого животного следует оценить количество отмеченных клеток, количество аберраций на клетку и процент клеток со структурными хромосомными аберрациями. Различные типы структурных хромосомных аберраций должны быть перечислены с указанием их количества и частоты для обработанных и контрольных групп. Пропуски регистрируются отдельно и сообщаются, но обычно не включаются в общую частоту аберраций. Если нет никаких доказательств разницы в реакции между полами, данные обоих полов могут быть объединены для статистического анализа.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев определения положительного результата, таких как дозозависимое увеличение относительного количества клеток с хромосомными аберрациями или явное увеличение количества клеток с аберрациями в группе с однократной дозой в одно время отбора проб. В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний (6). Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа. Сомнительные результаты следует уточнить путем дальнейшего тестирования, предпочтительно с использованием модификации экспериментальных условий.

Увеличение полиплоидии может указывать на то, что тестируемое вещество потенциально может вызывать числовые хромосомные аберрации. Увеличение эндоредупликации может указывать на то, что тестируемое вещество может ингибировать прогрессирование клеточного цикла (7) (8).

Испытуемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этом тесте.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от количества проведенных экспериментов.

Положительные результаты теста на хромосомные аберрации in vivo указывают на то, что вещество вызывает хромосомные аберрации в костном мозге тестируемых видов. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытаний испытуемое вещество не вызывает хромосомных аберраций в костном мозге испытуемых видов.

Следует обсудить вероятность того, что тестируемое вещество или его метаболиты попадут в общий кровоток или конкретно в ткань-мишень (например, системная токсичность).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Отчет об испытаниях должен включать следующую информацию:

Растворитель:

- обоснование выбора транспортного средства,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Тестовые животные:

- используемый вид/штамм,

- количество, возраст и пол животных,

- источник, жилищные условия, рацион и т.д.,

- индивидуальный вес животных в начале испытания, включая диапазон массы тела, средние значения и стандартное отклонение для каждой группы.

Условия испытаний:

- положительный и отрицательный контроль (носитель/растворитель),

- данные исследования по определению диапазона, если оно проводилось,

- обоснование выбора близкого уровня,

- подробности приготовления тестируемого вещества,

- подробности введения испытуемого вещества,

- обоснование пути введения,

- методы проверки того, что испытуемое вещество достигло общего кровообращения или целевой ткани, если применимо,

- преобразование концентрации исследуемого вещества в рационе/питьевой воде (ppm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела/день), если применимо,

- сведения о качестве продуктов питания и воды,

- подробное описание графиков обработки и отбора проб,

- методы измерения токсичности,

- личность вещества, задерживающего метафазу, его концентрация и продолжительность лечения,

- методы подготовки слайдов,

- критерии оценки аберраций,

- количество проанализированных клеток на животное,

- критерии признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными.

Полученные результаты:

- признаки токсичности,

- митотический индекс,

- вид и количество аберраций, указываются отдельно для каждого животного,

- общее количество аберраций на группу со средними значениями и стандартными отклонениями,

- количество клеток с аберрациями на группу со средними значениями и стандартными отклонениями,

- изменения плоидности, если они наблюдаются,

- взаимосвязь «доза-реакция», где это возможно,

- статистический анализ, если таковой имеется,

- данные одновременного отрицательного контроля,

- исторические данные отрицательного контроля с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями,

- данные одновременного положительного контроля.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Адлер, И.Д. (1984), Цитогенетические тесты на млекопитающих, в: Тестирование на мутагенность: практический подход, С. Венитт и Дж. М. Парри (редакторы), IRL Press, Оксфорд, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 275-306.

(2) Престон Р.Дж., Дин Б.Дж., Галлоуэй С., Холден Х., Макфи А.Ф. и Шелби М. (1987), Цитогенетические анализы млекопитающих in vivo: анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга, мутации. ., 189, стр. 157-165.

(3) Ричольд М., Чендли А., Эшби Дж., Гейтхаус Д.Г., Бутман Дж. и Хендерсон Л. (1990), Цитогенетические анализы in vivo, в: DJ Kirkland (ред.), Basic Тесты на мутагенность, рекомендуемые процедуры UKEMS. Подкомитет UKEMS по рекомендациям по испытаниям на мутагенность. Отчет, переработанная часть I, издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 115–141.

(4) Тайс , РР , Хаяши , М , МакГрегаро , Джей Ти , Андерсон , Д , Блейки , Д.Х. , Холден , ХЭ , Кирш-Волдерс , М , Олесон младший , Ф.Б. , Пакьеротти , Ф , Престон , Р.Дж. . , Романья , Ф , Шимада Х., Суто С. и Ваннье Б. (1994), Отчет рабочей группы по тесту на хромосомные аберрации костного мозга млекопитающих in vivo, Mutation Res. 305-312.

(5) Филдер, Р.Дж., Аллен, Дж.А., Бубис, А.Р., Ботам, П.А., Доу, Дж., Эсдейл, Д.Дж., Гейтхаус, Д.Г., Ходсон-Уокер, Г., Мортон, Д.Б., Киркланд, Д.Дж. и Ричолд, М. (1992), Отчет Рабочей группы Британского токсикологического общества/Британского общества по экологическим мутагенам: Установление дозы в анализах мутагенности in vivo, Мутагенез, 7, стр. 313-319.

(6) Ловелл Д.П., Андерсон Д., Альбанезе Р., Амфлетт Дж.Э., Клэр Г., Фергюсон Р., Ричолд М., Папуорт Д.Г. и Сэвидж Дж.Р.К. (1989), Статистический анализ Цитогенетические анализы in vivo, в: Подкомитет UKEMS по рекомендациям по тестированию на мутагенность, отчет, часть III. Статистическая оценка данных испытаний на мутагенность, Д. Дж. Киркланд (ред.) Издательство Кембриджского университета, Кембридж, стр. 184-232.

(7) Locke-Huhle, C. (1983), Эндоредупликация в клетках китайского хомячка во время индуцированного альфа-излучением ареста G2, Mutation Res., 119, стр. 403-413.

(8) Хуанг Ю., Чейндж К. и Троско Дж. Э. (1983), Афидиколин-индуцированная эндоредупликация в клетках китайского хомячка, Cancer Res., 43, стр. 1362-1364.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4С

«B.12. МУТАГЕННОСТЬ – МИКРОЯДЕРНЫЙ ТЕСТ НА ЭРИТРОЦИТАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 474, Микроядерный тест эритроцитов млекопитающих (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Микроядерный тест in vivo у млекопитающих применяют для выявления повреждений, вызванных тестируемым веществом хромосом или митотического аппарата эритробластов, путем анализа эритроцитов, взятых из костного мозга и/или клеток периферической крови животных, обычно грызунов.

Цель микроядерного теста – выявление веществ, вызывающих цитогенетические повреждения, приводящие к образованию микроядер, содержащих отстающие фрагменты хромосом или целые хромосомы.

Когда эритробласт костного мозга развивается в полихроматический эритроцит, основное ядро ​​выдавливается; любое образовавшееся микроядро может остаться в безъядерной цитоплазме. В этих клетках облегчается визуализация микроядер, поскольку у них отсутствует главное ядро. Увеличение частоты микроядерных полихроматических эритроцитов у обработанных животных является показателем индуцированного повреждения хромосом.

В этом тесте обычно используется костный мозг грызунов, поскольку в этой ткани вырабатываются полихроматические эритроциты. Измерение микроядерных незрелых (полихроматических) эритроцитов в периферической крови одинаково приемлемо у любого вида, у которого была продемонстрирована неспособность селезенки удалять микроядерные эритроциты или который показал адекватную чувствительность для обнаружения агентов, вызывающих структурные или числовые хромосомные аберрации. . Микроядра можно отличить по ряду критериев. К ним относится идентификация наличия или отсутствия кинетохорной или центромерной ДНК в микроядрах. Частота микроядерных незрелых (полихроматических) эритроцитов является основным конечным показателем. Число зрелых (нормохроматических) эритроцитов в периферической крови, содержащих микроядра, среди заданного количества зрелых эритроцитов также можно использовать в качестве конечной точки анализа, когда животных лечат в течение четырех недель или более.

Этот микроядерный тест in vivo на млекопитающих особенно важен для оценки мутагенной опасности, поскольку он позволяет учитывать факторы метаболизма, фармакокинетики и процессов репарации ДНК in vivo, хотя они могут варьироваться в зависимости от вида, ткани и генетических конечных точек. Анализ in vivo также полезен для дальнейшего изучения мутагенного эффекта, обнаруженного системой in vitro.

Если есть свидетельства того, что тестируемое вещество или реактивный метаболит не достигнет ткани-мишени, использовать этот тест нецелесообразно.

См. также «Общее введение», часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Центромера (кинетохор): область(и) хромосомы, с которой волокна веретена связаны во время деления клетки, обеспечивая упорядоченное перемещение дочерних хромосом к полюсам дочерних клеток.

Микроядра: небольшие ядра, отдельные и дополнительные к основным ядрам клеток, образующиеся во время телофазы митоза (мейоза) за счет отстающих фрагментов хромосом или целых хромосом.

Нормохроматический эритроцит: зрелый эритроцит, лишенный рибосом, который можно отличить от незрелых полихроматических эритроцитов с помощью селективного окрашивания в отношении рибосом.

Полихроматический эритроцит: незрелый эритроцит, находящийся на промежуточной стадии развития, который все еще содержит рибосомы и поэтому его можно отличить от зрелых нормохроматических эритроцитов с помощью селективного окрашивания рибосом.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Животные подвергаются воздействию тестируемого вещества соответствующим путем. Если используется костный мозг, животных умерщвляют в подходящее время после лечения, извлекают костный мозг, готовят и окрашивают препараты (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). При использовании периферической крови ее собирают в соответствующие моменты после лечения, готовят и окрашивают мазки (4) (8) (9) (10). Для исследований с периферической кровью между последним воздействием и сбором клеток должно пройти как можно меньше времени. Препараты анализируют на наличие микроядер.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Выбор вида животных

Если используется костный мозг, рекомендуется использовать мышей или крыс, хотя можно использовать любые подходящие виды млекопитающих. При использовании периферической крови рекомендуется использовать мышей. Однако можно использовать любой подходящий вид млекопитающих при условии, что это вид, у которого селезенка не удаляет микроядерные эритроциты, или вид, который показал адекватную чувствительность для обнаружения агентов, вызывающих структурные или числовые хромосомные аберрации. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых животных. В начале исследования вариация массы животных должна быть минимальной и не превышать ±20 % средней массы каждого пола.

1.4.1.2. Условия содержания и кормления

Применяются общие условия, указанные в Общем введении к Части B, хотя целевая влажность должна составлять 50–60 %.

1.4.1.3. Подготовка животных

Здоровые молодые взрослые животные случайным образом распределяются в контрольную и экспериментальную группы. Животные идентифицируются однозначно. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям не менее пяти дней. Клетки должны быть расположены таким образом, чтобы возможные последствия их размещения были сведены к минимуму.

1.4.1.4. Приготовление доз

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед введением животным. Жидкие тестируемые вещества можно дозировать непосредственно или разбавлять перед дозированием. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен оказывать токсического воздействия при используемых дозах и не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подкреплено справочными данными, указывающими их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассматривать возможность использования водного растворителя/носителя.

1.4.2.2. Элементы управления

В каждом тесте для каждого пола должны быть включены одновременные положительные и отрицательные контроли (растворитель/носитель). За исключением обработки тестируемым веществом, с животными контрольных групп следует обращаться так же, как с животными экспериментальных групп.

Положительные контроли должны производить микроядра in vivo при уровнях воздействия, которые, как ожидается, будут давать заметное увеличение по сравнению с фоном. Положительные контрольные дозы следует выбирать так, чтобы эффект был очевиден, но не раскрывал сразу читателю идентичность закодированных слайдов. Допустимо, чтобы положительный контроль вводился способом, отличным от испытуемого вещества, и пробы отбирались только один раз. Кроме того, можно рассмотреть возможность использования химических веществ положительного контроля, соответствующих химическому классу, если таковые имеются. Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Отрицательные контроли, обработанные только растворителем или наполнителем и иным образом обработанные так же, как и группы лечения, должны быть включены для каждого времени отбора проб, если только исторические контрольные данные не демонстрируют приемлемую вариабельность между животными и частоту клеток с микроядрами. Если для отрицательного контроля применяется однократный отбор проб, наиболее подходящим временем является время первого отбора проб. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, за исключением случаев, когда имеются исторические или опубликованные данные по контролю, демонстрирующие, что выбранный растворитель/носитель не вызывает никаких вредных или мутагенных эффектов.

Если используется периферическая кровь, образец предварительной обработки также может быть приемлем в качестве одновременного отрицательного контроля, но только в коротких исследованиях периферической крови (например, 1-3 курса лечения), когда полученные данные находятся в ожидаемом диапазоне для исторический контроль.

1,5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Количество и пол животных

Каждая обработанная и контрольная группы должны включать не менее пяти поддающихся анализу животных каждого пола (11). Если на момент проведения исследования имеются данные исследований на одних и тех же видах и с использованием одного и того же пути воздействия, которые демонстрируют отсутствие существенных различий между полами в токсичности, то тестирования на одном поле будет достаточно. Если воздействие химических веществ на человека может зависеть от пола, как, например, в случае с некоторыми фармацевтическими агентами, испытания следует проводить на животных соответствующего пола.

1.5.2. График лечения

Никакая стандартная схема лечения (т. е. одна, две или более процедур с 24-часовыми интервалами) не может быть рекомендована. Образцы из расширенных режимов дозирования приемлемы до тех пор, пока в этом исследовании был продемонстрирован положительный эффект или, в случае отрицательного исследования, до тех пор, пока была продемонстрирована токсичность или была использована предельная доза, и дозирование продолжалось до момента отбора проб. . Тестируемые вещества также можно вводить в виде разделенной дозы, т.е. две обработки в один и тот же день с интервалом не более нескольких часов, чтобы облегчить введение большого объема материала.

Тест может быть выполнен двумя способами:

(а) животных обрабатывают испытуемым веществом однократно. Пробы костного мозга отбирают не менее двух раз, начиная не ранее чем через 24 часа после обработки, но не позднее чем через 48 часов после обработки, с соответствующими интервалами между пробами. Использование времени отбора проб ранее, чем через 24 часа после лечения, должно быть оправдано. Пробы периферической крови берут не менее двух раз, начиная не ранее чем через 36 часов после лечения, с соответствующими интервалами после первой пробы, но не превышающими 72 часов. Если положительный ответ получен в один момент отбора проб, дополнительный отбор проб не требуется;

(b) Если используются две или более ежедневные обработки (например, две или более процедур с 24-часовыми интервалами), образцы следует собирать один раз между 18 и 24 часами после последней обработки костного мозга и один раз между 36 и 48 часами после заключительное лечение периферической крови (12).

Кроме того, при необходимости можно использовать и другие времена выборки.

1.5.3. Уровни доз

Если исследование по определению диапазона проводится из-за отсутствия подходящих данных, его следует проводить в той же лаборатории с использованием того же вида, штамма, пола и схемы лечения, которые использовались в основном исследовании (13). Если имеется токсичность, для первого отбора проб используются три уровня дозы. Эти уровни доз должны охватывать диапазон от максимальной до незначительной токсичности или отсутствия токсичности. В более позднее время отбора проб необходимо использовать только самую высокую дозу. Наивысшая доза определяется как доза, вызывающая признаки токсичности, при которой можно ожидать, что более высокие уровни дозы, основанные на том же режиме дозирования, приведут к летальному исходу. Вещества со специфической биологической активностью в низких нетоксичных дозах (например, гормоны и митогены) могут быть исключениями из критериев установления дозы и должны оцениваться в каждом конкретном случае. Высшую дозу также можно определить как дозу, которая вызывает некоторые признаки токсичности в костном мозге (например, снижение доли незрелых эритроцитов среди общего количества эритроцитов в костном мозге или периферической крови).

1.5.4. Предельный тест

Если тест с одной дозой по меньшей мере 2000 мг/кг массы тела с использованием однократного лечения или двух обработок в один и тот же день не дает наблюдаемых токсических эффектов и если на основании данных о структурно родственных веществах не следует ожидать генотоксичности , то полное исследование с использованием трех уровней доз может не считаться необходимым. Для исследований более длительной продолжительности предельная доза составляет 2000 мг/кг/массу тела/день для лечения длительностью до 14 дней и 1000 мг/кг/массу тела/день для лечения более 14 дней. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня дозы в предельном испытании.

1.5.5. Введение доз

Тестируемое вещество обычно вводят через зонд с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли или путем внутрибрюшинной инъекции. Другие пути воздействия могут быть приемлемыми, если они оправданы. Максимальный объем жидкости, который можно вводить через зонд или путем инъекции за один раз, зависит от размера подопытного животного. Объем не должен превышать 2 мл/100 г массы тела. Использование более высоких объемов должно быть оправдано. За исключением раздражающих или разъедающих веществ, действие которых обычно усиливается при более высоких концентрациях, изменчивость испытательного объема следует свести к минимуму путем корректировки концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.5.6. Подготовка костного мозга/крови

Клетки костного мозга обычно получают из бедренных или большеберцовых костей сразу после умерщвления. Обычно клетки берут из бедренных или большеберцовых костей, подготавливают и окрашивают с использованием общепринятых методов. Периферическую кровь получают из хвостовой вены или другого подходящего кровеносного сосуда. Клетки крови немедленно окрашивают наджизненно (8) (9) (10) или готовят мазки и затем окрашивают. Использование ДНК-специфического красителя (например, акридинового оранжевого (14) или Hoechst 33258 плюс пиронин-Y (15)) может устранить некоторые артефакты, связанные с использованием неспецифического для ДНК красителя. Это преимущество не исключает использования обычных красителей (например, Гимзы). Дополнительные системы (например, целлюлозные колонки для удаления ядросодержащих клеток (16)) также могут использоваться при условии, что эти системы адекватно работают для подготовки микроядер в лаборатории.

1.5.7. Анализ

Доля незрелых эритроцитов среди общего числа (незрелых + зрелых) определяется для каждого животного путем подсчета суммарно не менее 200 эритроцитов для костного мозга и 1000 эритроцитов для периферической крови (17). Все предметные стекла, включая положительные и отрицательные контроли, перед микроскопическим анализом должны быть независимо закодированы. По крайней мере, 2000 незрелых эритроцитов на животное оценивают для определения частоты появления микроядерных незрелых эритроцитов. Дополнительную информацию можно получить путем оценки зрелых эритроцитов на наличие микроядер. При анализе препаратов доля незрелых эритроцитов среди общего количества эритроцитов не должна быть менее 20 % от контрольного значения. Когда животных лечат непрерывно в течение четырех недель или более, по меньшей мере, 2000 зрелых эритроцитов на животное также могут быть оценены для выявления микроядер. Системы автоматического анализа (анализ изображений и проточный цитометрический анализ клеточных суспензий) являются приемлемой альтернативой ручной оценке, если они соответствующим образом обоснованы и проверены.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные по отдельным животным должны быть представлены в табличной форме. Экспериментальная единица – животное. Количество подсчитанных незрелых эритроцитов, количество микроядерных незрелых эритроцитов и количество незрелых среди общего числа эритроцитов следует указывать отдельно для каждого анализируемого животного. При непрерывном лечении животных в течение четырех недель и более следует также предоставить данные о зрелых эритроцитах, если они собираются. Доля незрелых эритроцитов и, если это считается применимым, процент микроядерных эритроцитов указаны для каждого животного. Если нет никаких доказательств разницы в реакции между полами, данные обоих полов могут быть объединены для статистического анализа.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев для определения положительного результата, таких как дозозависимое увеличение количества микроядерных клеток или явное увеличение количества микроядерных клеток в группе с однократной дозой за одно время отбора проб. В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний (18) (19). Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа. Сомнительные результаты следует уточнить путем дальнейшего тестирования, предпочтительно с использованием модификации экспериментальных условий.

Испытуемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этом тесте.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительные результаты микроядерного теста свидетельствуют о том, что вещество индуцирует микроядра, являющиеся результатом хромосомного повреждения или повреждения митотического аппарата в эритробластах тест-видов. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытания испытуемое вещество не образует микроядра в незрелых эритроцитах испытуемого вида.

Следует обсудить вероятность того, что тестируемое вещество или его метаболиты попадут в общий кровоток или конкретно в ткань-мишень (например, системная токсичность).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Отчет об испытаниях должен включать следующую информацию:

Растворитель/носитель:

- обоснование выбора транспортного средства,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Тестовые животные:

- используемый вид/штамм,

- количество, возраст и пол животных,

- источник, жилищные условия, рацион и т.д.,

- индивидуальный вес животных в начале испытания, включая диапазон массы тела, среднее значение и стандартное отклонение для каждой группы.

Условия испытаний:

- положительные и отрицательные данные контроля (носитель/растворитель),

- данные исследования по определению диапазона, если оно проводилось,

- обоснование выбора уровня дозы,

- подробности приготовления тестируемого вещества,

- подробности введения испытуемого вещества,

- обоснование пути введения,

- методы проверки того, что испытуемое вещество достигло общего кровообращения или целевой ткани, если применимо,

- преобразование концентрации исследуемого вещества в рационе/питьевой воде (ppm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела/день), если применимо,

- сведения о качестве продуктов питания и воды,

- подробное описание графиков обработки и отбора проб,

- методы подготовки слайдов,

- методы измерения токсичности,

- критерии оценки микроядерных незрелых эритроцитов,

- количество проанализированных клеток на животное,

- критерии признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными.

Полученные результаты:

- признаки токсичности,

- доля незрелых эритроцитов среди общего количества эритроцитов,

- количество микроядерных незрелых эритроцитов, приведенное отдельно для каждого животного,

- среднее значение ± стандартное отклонение микроядерных незрелых эритроцитов на группу,

- взаимосвязь «доза-реакция», где это возможно,

- статистический анализ и применяемые методы,

- одновременные и исторические отрицательные данные,

- данные одновременного положительного контроля.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Хеддл, Дж. А. (1973), Быстрый тест in vivo на хромосомные повреждения, Mutation Res., 18, стр. 187-190.

(2) Шмид, В. (1975), Микроядерный тест, Mutation Res., 31, стр. 9-15.

(3) Хеддл Дж. А., Саламоне М. Ф., Хайт М., Киркхарт Б., Маворнин К., МакГрегор Дж. Г. и Ньюэлл Г. В. (1983), Индукция микроядер как мера генотоксичности, Mutation Res. 123, стр. 61-118.

(4) Маворнин К.Х., Блейки Д.Х., Чимино М.К., Саламоне М.Ф. и Хеддл Дж.А. (1990), Микроядерный анализ in vivo в костном мозге и периферической крови млекопитающих. Отчет Программы Gene-Tox Агентства по охране окружающей среды США, Mutation Res., 239, стр. 29–80.

(5) МакГрегор Дж.Т., Шлегель Р., Чой В.Н. и Вер К.М. (1983), Микроядра в циркулирующих эритроцитах: быстрый скрининг хромосомных повреждений во время рутинного тестирования токсичности на мышах, в: Развитие науки и практики токсикологии. , изд. А. В. Хейс, Р. К. Шнелл и Т. С. Мия. Elsevier, Амстердам, стр. 555–558.

(6) МакГрегор Дж. Т., Хеддл Дж. А. Хайт М., Марголин Г. Х., Рамель К., Саламоне М. Ф., Тайс Р. Р. и Уайлд Д. (1987), Рекомендации по проведению микроядерных анализов у ​​млекопитающих. Эритроциты костного мозга, Mutation Res., 189, стр. 103-112.

(7) МакГрегор Дж.Т., Вер К.М., Хеника П.Р. и Шелби М.Е. (1990), Микроядерный тест эритроцитов in vivo: измерение в стационарном состоянии повышает эффективность анализа и позволяет интегрировать его с исследованиями токсичности, Fund. Прил. Токсикол. 14, стр. 513-522.

(8) Хаяси М., Морита Т., Кодама Ю., Софуми Т. и Исидате М. младший (1990), Микроядерный анализ ретикулоцитов периферической крови мыши с использованием предметных стекол с акридиновым оранжевым покрытием, мутация Res ., 245, с. 245-249.

(9) Совместная исследовательская группа по микроядерному тесту (1992). Микроядерный тест с эритроцитами периферической крови мышей с помощью надвитального окрашивания акридимом оранжевым: сводный отчет 5-го совместного исследования, проведенного CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, стр. 83-98.

(10) Совместная исследовательская группа по микроядерному тесту (CSGMT/JEMMS, MMS: Группа по изучению мутагенеза млекопитающих Общества экологических мутагенов Японии) (1995), Протокол, рекомендованный для краткосрочного микроядерного теста периферической крови мышей, Мутагенез, 10, стр. 53–159.

(11) Хаяши, М., Тайс, Р.Р., МакГрегор, Дж.Т., Андерсон, Д., Блэки, Д.Х., Кирш-Волдерс, М., Олесон-младший. F.B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. и Vannier, B. (1994), Микроядерный анализ эритроцитов на грызунах in vivo, Mutation Res. 293-3

(12) Хигашикуни Н. и Суто С. (1995), Оптимальное обобщенное время отбора проб 30 ± 6 часов после двойного введения дозы в тесте на периферические микроядра мышей, Мутагенез, 10, стр. 313-319.

(13) Филдер, Р.Дж., Аллен, Дж.А., Бубис, А.Р., Ботам, П.А., Доу, Дж., Эсдейл, Д.Дж., Гейтхаус, Д.Г., Ходсон-Уокер, Дж., Мортон, Д.Б., Киркланд, Д.Дж. и Рохолд, М. (1992), Отчет Рабочей группы Британского токсикологического общества/Британского общества по экологическим мутагенам: Установление дозы в анализах мутагенности in vivo, Мутагенез, 7, стр. 313-319.

(14) Хаяси М., Софуми Т. и Исидате М. младший (1983), Применение флуоресцентного окрашивания акридиновым оранжевым для микроядерного теста, Mutation Res., 120, стр. 241-247.

(15) МакГрегор Дж.Т., Вер С.М. и Ланглуа Р.Г. (1983), Простая процедура флуоресцентного окрашивания микроядер и РНК в эритроцитах с использованием Hoechst 33258 и пиромина Y, Mutation Res., 120, стр. 269-275.

(16) Романья Ф. и Станифорт К.Д. (1989), Автоматизированный микроядерный тест костного мозга, Mutation Res., 213, стр. 91-104.

(17) Голлапуди Б. и Макфадден Л.Г. (1995), Размер выборки для оценки соотношения полихроматических и нормохроматических эритроцитов в микроядерном тесте костного мозга, Mutation Res., 347, стр. 97-99.

(18) Ричольд М., Эшби Дж., Бутман Дж., Чэндли А., Гейтхаус Д.Г. и Хендерсон Л. (1990), Цитогенетический анализ in vivo, в: DJ Kirkland (ред.), Basic Испытания на мутагенность, Рекомендуемые процедуры UKEMS, Подкомитет UKEMS по рекомендациям по испытаниям на мутагенность. Отчет, Часть 1, исправленная версия, Издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 115–141.

(19) Ловелл Д.П., Андерсон Д., Альбанезе Р., Амфлетт Дж.Э., Клэр Г., Фергюсон Р., Ричольд М., Папуорт Д.Г. и Сэвидж Дж.Р.К. (1989), Статический анализ In Цитогенетические анализы Vivo, в: DJ Kirkland (ред.), Статистическая оценка данных испытаний на мутагенность. Подкомитет UKEMS по рекомендациям по испытаниям на мутагенность. Отчет, часть III, издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 184–232».

ПРИЛОЖЕНИЕ 4D

"B.13/14. МУТАГЕННОСТЬ - ТЕСТ ОБРАТНОЙ МУТАЦИИ БАКТЕРИЙ

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 471, Тест на обратную мутацию бактерий (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Бактериальный тест на обратную мутацию использует аминокислоты, необходимые штаммам Salmonella typhimurium и Escherichia coli для обнаружения точечных мутаций, которые включают замену, добавление или удаление одной или нескольких пар оснований ДНК (1), (2) (3). Принцип этого бактериального теста на обратную мутацию заключается в том, что он обнаруживает мутации, которые обращают вспять мутации, присутствующие в тест-штаммах, и восстанавливают функциональную способность бактерий синтезировать незаменимую аминокислоту. Ревертантные бактерии выявляются по их способности расти в отсутствие аминокислоты, необходимой родительскому тест-штамму.

Точечные мутации являются причиной многих генетических заболеваний человека, и имеются убедительные доказательства того, что точковые мутации в онкогенах и генах-супрессорах опухолей соматических клеток участвуют в образовании опухолей у человека и экспериментальных животных. Тест на обратную мутацию бактерий является быстрым, недорогим и относительно простым в исполнении. Многие из тестовых штаммов обладают рядом особенностей, которые делают их более чувствительными к обнаружению мутаций, включая чувствительные последовательности ДНК в местах реверсии, повышенную проницаемость клеток для крупных молекул и устранение систем репарации ДНК или усиление процессов репарации ДНК, подверженных ошибкам. Специфичность тест-штаммов может дать некоторую полезную информацию о типах мутаций, вызываемых генотоксичными агентами. Для тестов на обратную мутацию бактерий доступна очень большая база данных результатов для самых разных структур, и были разработаны хорошо зарекомендовавшие себя методологии для тестирования химических веществ с различными физико-химическими свойствами, включая летучие соединения.

См. также «Общее введение», часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Тест на обратную мутацию либо в Salmonella typhimurium, либо в Escherichia coli выявляет мутацию в аминокислоте, требующей штамма (гистидина или триптофана соответственно), для получения штамма, независимого от внешнего источника аминокислоты.

Мутагены замены пар оснований — это агенты, вызывающие изменение оснований в ДНК. В реверсионном тесте это изменение может произойти в месте исходной мутации или во втором участке бактериального генома.

Мутагены сдвига рамки считывания — это агенты, которые вызывают добавление или удаление одной или нескольких пар оснований в ДНК, изменяя тем самым рамку считывания в РНК.

1.3. ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЕ СООБРАЖЕНИЯ

В тесте на обратную мутацию бактерий используются прокариотические клетки, которые отличаются от клеток млекопитающих такими факторами, как поглощение, метаболизм, структура хромосом и процессы репарации ДНК. Тесты, проводимые in vitro, обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации. Системы метаболической активации in vitro не могут полностью имитировать условия in vivo млекопитающих. Таким образом, тест не дает прямой информации о мутагенной и канцерогенной активности вещества у млекопитающих.

Тест на обратную мутацию бактерий обычно используется в качестве первоначального скрининга генолоксической активности и, в частности, активности, индуцирующей точечные мутации. Обширная база данных показала, что многие химические вещества, показавшие положительный результат в этом тесте, также проявляют мутагенную активность в других тестах. Есть примеры мутагенных агентов, которые не обнаруживаются этим тестом; Причины этих недостатков можно объяснить специфической природой обнаруженной конечной точки, различиями в метаболической активации или различиями в биодоступности. С другой стороны, факторы, повышающие чувствительность теста на обратную мутацию бактерий, могут привести к завышенной оценке мутагенной активности.

Тест на обратную мутацию бактерий может оказаться неприемлемым для оценки некоторых классов химических веществ, например высокобактерицидных соединений (например, некоторых антибиотиков) и тех, которые, как считается (или известно), специфически влияют на систему репликации клеток млекопитающих (например, некоторые топоизомеразы). ингибиторы и некоторые аналоги нуклеозидов). В таких случаях более подходящими могут быть тесты на мутации млекопитающих.

Хотя многие соединения, показавшие положительный результат в этом тесте, являются канцерогенами для млекопитающих, корреляция не является абсолютной. Это зависит от химического класса, и существуют канцерогены, которые не обнаруживаются с помощью этого теста, поскольку они действуют посредством других, негенотоксичных механизмов или механизмов, отсутствующих в бактериальных клетках.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Суспензии бактериальных клеток подвергают воздействию тестируемого вещества в присутствии и в отсутствие экзогенной системы метаболической активации. При использовании метода включения в чашку эти суспензии смешивают с верхним агаром и сразу же высевают на минимальную среду. При методе преинкубации лечебную смесь инкубируют, а затем смешивают с верхним агаром перед высевом на минимальную среду. Для обоих методов после двух или трех дней инкубации подсчитывают ревертантные колонии и сравнивают их с количеством спонтанных ревертантных колоний на контрольных чашках с растворителем.

Описано несколько процедур проведения теста на обратную бактериальную мутацию. Среди наиболее часто используемых — метод включения чашек (1) (2) (3) (4), метод предварительной инкубации (2) (3) (5) (6) (7) (8), метод флуктуации (9) (10) и метод подвески (11). Описаны модификации для испытаний газов и паров (12).

Процедуры, описанные в методе, относятся в первую очередь к методам включения в планшеты и преинкубации. Любой из них приемлем для проведения экспериментов как с метаболической активацией, так и без нее. Некоторые вещества можно более эффективно обнаружить методом преинкубации. Эти вещества относятся к химическим классам, к которым относятся короткоцепочечные алифатические нитрозамины, двухвалентные металлы, альдегиды, азокрасители и диазосоединения, пирролизидиновые алкалоиды, аллильные соединения и нитросоединения (3). Также признано, что определенные классы мутагенов не всегда выявляются с помощью стандартных процедур, таких как метод включения в планшет или метод предварительной инкубации. Их следует рассматривать как «особые случаи», и для их обнаружения настоятельно рекомендуется использовать альтернативные процедуры. Можно выделить следующие «особые случаи» (вместе с примерами процедур, которые можно использовать для их обнаружения): азокрасители и диазосоединения (3) (5) (6) (13), газы и летучие химические вещества (12). (14) (15) (16) и гликозиды (17) (18). Отклонение от стандартной процедуры должно быть научно обосновано.

1,5. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.5.1. Препараты

1.5.1.1. Бактерии

Свежие культуры бактерий следует выращивать до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста (приблизительно 109 клеток на мл). Не следует использовать культуры в поздней стационарной фазе. Важно, чтобы используемые в эксперименте культуры содержали высокий титр жизнеспособных бактерий. Титр может быть продемонстрирован либо на основе исторических контрольных данных по кривым роста, либо в каждом анализе путем определения количества жизнеспособных клеток с помощью эксперимента по посеву.

Рекомендуемая температура инкубации — 37 °C.

Следует использовать не менее пяти штаммов бактерий. Они должны включать четыре штамма S. typhimurium (ТА 1535; ТА 1537 или ТА97а или ТА97; ТА98; и ТА100), которые доказали свою надежность и воспроизводимую реакцию в разных лабораториях. Эти четыре штамма S. typhimurium имеют пары оснований GC в сайте первичной реверсии, и известно, что они могут не обнаруживать определенные окислительные мутагены, сшивающие агенты и гидразины. Такие вещества могут быть обнаружены штаммами E. coli WP2 или S. typhimurium TA102 (19), которые имеют пару оснований АТ в первичном сайте реверсии. Поэтому рекомендуемая комбинация штаммов:

- S. typhimurium TA1535 и

- S. typhimurium ТА1537 или ТА97 или ТА97а, и

- S. typhimurium TA98 и

- S. typhimurium TA100 и

- E. coli WP2 uvrA, или E. coli WP2 uvrA (pKM101), или S. typhimurium TA102.

Для обнаружения перекрестно-сшивающих мутагенов может оказаться предпочтительным включить ТА102 или добавить штамм E.coli, способный к репарации ДНК (например, E.coli WP2 или E.coli WP2 (pKM101)).

Следует использовать установленные процедуры подготовки исходных культур, проверки маркеров и хранения. Потребность в аминокислотах для роста должна быть продемонстрирована для каждого препарата замороженной исходной культуры (гистидин для штаммов S. typhimurium и триптофан для штаммов E. coli). Другие фенотипические характеристики должны быть проверены аналогичным образом, а именно: наличие или отсутствие плазмид R-фактора, где это необходимо (т.е. устойчивость к ампициллину у штаммов TA98, TA100 и TA97a или TA97, WP2 uvrA и WP2 uvrA (pKM101) и устойчивость к ампициллину + тетрациклину. у штамма ТА 102); наличие характерных мутаций (например, мутация rfa у S. typhimurium из-за чувствительности к кристаллическому фиолетовому и мутация uvrA в E. coli или мутация uvrB в S. typhimurium из-за чувствительности к ультрафиолетовому свету) (2) (3). Штаммы также должны давать спонтанные ревертантные колонии на чашках в пределах частот, ожидаемых на основании данных исторического контроля лаборатории, и предпочтительно в пределах диапазона, указанного в литературе.

1.5.1.2. Середина

Используют соответствующий минимальный агар (например, содержащий минимальную среду Фогеля-Боннера E и глюкозу) и верхний агар, содержащий гистидин и биотин или триптофан, позволяющий провести несколько делений клеток (1), (2) (9).

1.5.1.3. Метаболическая активация

Бактерии следует подвергать воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора (S9), полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты, такими как Aroclor 1254 (1) (2) или комбинацией фенобарбитона и β-нафтофлавона (18 ) (20) (21). Постмитохондриальную фракцию обычно используют в концентрациях от 5 до 30 % об./об. в смеси S9. Выбор и состояние системы метаболической активации могут зависеть от класса тестируемого химического вещества. В некоторых случаях может оказаться целесообразным использовать более одной концентрации постмитохондриальной фракции. Для азокрасителей и диазосоединений более целесообразным может быть использование системы восстановительной метаболической активации (6) (13).

1.5.1.4. Испытуемое вещество/препарат

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед обработкой бактерий. Жидкие тестовые вещества можно добавлять непосредственно в тест-системы и/или разбавлять перед обработкой. Свежие препараты следует использовать, если данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

Растворитель/носитель не должен вызывать подозрений в химической реакции с тестируемым веществом и должен быть совместим с выживанием бактерий и активностью S9 (22). Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подтверждено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя. При испытании неустойчивых к воде веществ используемые органические растворители не должны содержать воды.

1.5.2. Условия испытаний

1.5.2.1. Тестовые штаммы (см. 1.5.1.1)

1.5.2.2. Концентрация воздействия

Среди критериев, которые следует учитывать при определении максимального количества используемого тестируемого вещества, - цитотоксичность и растворимость в конечной лечебной смеси.

Может быть полезно определить токсичность и нерастворимость в предварительном эксперименте. Цитотоксичность можно обнаружить по уменьшению числа ревертантных колоний, очистке или уменьшению фонового газона или степени выживаемости обработанных культур. Цитотоксичность вещества может изменяться в присутствии систем метаболической активации. Нерастворимость следует оценивать как осаждение в конечной смеси в реальных условиях испытаний, заметное невооруженным глазом.

Рекомендуемая максимальная тестовая концентрация растворимых нецитотоксичных веществ составляет 5 мг/планшет или 5 мкл/планшет. Для нецитотоксичных веществ, которые не растворяются в дозах 5 мг/планшет или 5 мкл/планшет, одна или несколько испытуемых концентраций должны быть нерастворимы в конечной лечебной смеси. Тестируемые вещества, цитотоксичность которых уже ниже 5 мг/планшет или 5 мкл/планшет, следует тестировать до цитотоксической концентрации. Осадок не должен мешать подсчету очков.

Для начального эксперимента следует использовать не менее пяти различных анализируемых концентраций испытуемого вещества с интервалами примерно в половину логарифма (т.е. [радик]10) между контрольными точками. Меньшие интервалы могут быть целесообразными, когда исследуется реакция концентрации. При оценке веществ, содержащих значительные количества потенциально мутагенных примесей, можно рассмотреть возможность тестирования при концентрации выше 5 мг/чашку или 5 мкл/планшет.

1.5.2.3. Отрицательный и положительный контроль

В каждый анализ следует включать параллельные штаммоспецифичные положительные и отрицательные контроли (растворитель или носитель), как с метаболической активацией, так и без нее. Следует выбирать концентрации положительного контроля, которые демонстрируют эффективную эффективность каждого анализа.

Для анализов, использующих систему метаболической активации, эталонное вещество(а) положительного контроля следует выбирать на основе типа используемых штаммов бактерий.

Следующие вещества являются примерами подходящих положительных контролей для анализов с метаболической активацией:

>ТАБЛИЦА>

Следующее вещество является подходящим положительным контролем для метода восстановительной метаболической активации:

>ТАБЛИЦА>

2-аминоантрацен не следует использовать в качестве единственного индикатора эффективности смеси S9. При использовании 2-аминоантрацена каждую партию S9 следует также характеризовать наличием мутагена, требующего метаболической активации микросомальными ферментами, например, бензо[а]пирена, диметилбензантрацена.

Следующие вещества являются примерами штамм-специфических положительных контролей для анализов, проводимых без экзогенной системы метаболической активации:

>ТАБЛИЦА>

Могут быть использованы другие соответствующие эталонные вещества положительного контроля. Следует рассмотреть возможность использования химических веществ положительного контроля, соответствующих химическому классу, если таковые имеются.

Отрицательные контроли, состоящие только из растворителя или носителя, без тестируемого вещества и обработанные в остальном так же, как и группы обработки, должны быть включены. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, если нет исторических данных по контролю, демонстрирующих, что выбранный растворитель не вызывает никаких вредных или мутагенных эффектов.

1.5.3. Процедура

Для метода включения в планшет (1) (2) (3) (4) без метаболической активации обычно 0,05 мл или 0,1 мл тестируемых растворов, 0,1 мл свежей бактериальной культуры (содержащей примерно 108 жизнеспособных клеток) и 0,5 мл стерильного буфера смешивают с 2,0 мл наложенного агара. Для анализа с метаболической активацией обычно 0,5 мл смеси метаболической активации, содержащей достаточное количество постмитохондриальной фракции (в диапазоне от 5 до 30 % об./об. в смеси метаболической активации), смешивают с верхним агаром ( 2,0 мл) вместе с бактериями и тестируемым веществом/тестовым раствором. Содержимое каждой пробирки перемешивают и выливают на поверхность минимальной пластинки с агаром. Наложенному агару дают затвердеть перед инкубацией.

Для метода преинкубации (2) (3) (5) (6) тестируемое вещество/тестируемый раствор предварительно инкубируют с тест-штаммом (содержащим примерно 108 жизнеспособных клеток) и стерильным буфером или системой метаболической активации (0,5 мл). обычно в течение 20 минут или более при температуре 30–37 °C, прежде чем смешивать с верхним агаром и выливать на поверхность минимальной пластинки с агаром. Обычно 0,05 или 0,1 мл тестируемого вещества/тестового раствора, 0,1 мл бактерий и 0,5 мл смеси S9 или стерильного буфера смешивают с 2,0 мл агара верхнего слоя. Во время предварительной инкубации пробирки следует аэрировать с помощью шейкера.

Для адекватной оценки вариации следует использовать трехкратное высев на чашку для каждого уровня дозы. Использование дублирующих покрытий допускается, если это научно обосновано. Случайная потеря планшета не обязательно делает анализ недействительным.

Газообразные или летучие вещества следует проверять соответствующими методами, например, в запечатанных сосудах (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Инкубация

Все планшеты для данного анализа следует инкубировать при температуре 37 °C в течение 48–72 часов. После инкубационного периода подсчитывают количество ревертантных колоний на чашку.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные должны быть представлены как количество ревертантных колоний на чашку. Также необходимо указать количество ревертантных колоний как на отрицательных (контроль растворителем и необработанный контроль, если используется), так и на чашках положительного контроля. Подсчет отдельных чашек, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение должны быть представлены для испытуемого вещества и положительных и отрицательных (необработанных и/или растворителей) контролей.

Нет необходимости проверять четкий положительный ответ. Сомнительные результаты следует уточнить путем дальнейшего тестирования, предпочтительно с использованием модификации экспериментальных условий. Отрицательные результаты необходимо подтверждать в каждом конкретном случае. В тех случаях, когда подтверждение отрицательных результатов не считается необходимым, должно быть предоставлено обоснование. Модификацию параметров исследования для расширения диапазона оцениваемых условий следует учитывать в последующих экспериментах. Параметры исследования, которые могут быть изменены, включают интервал концентраций, метод лечения (внесение в чашку или предварительная инкубация в жидкости) и условия метаболической активации.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев для определения положительного результата, таких как связанное с концентрацией увеличение по сравнению с тестируемым диапазоном и/или воспроизводимое увеличение при одной или нескольких концентрациях количества ревертантных колоний на чашку по крайней мере у одного штамма с метаболической активацией или без нее. система (23). В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний (24). Однако статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа.

Испытуемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этом тесте.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительные результаты теста на обратную бактериальную мутацию указывают на то, что вещество вызывает точковые мутации путем замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме Salmonella typhimurium и/или Escherichia coli. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытаний испытуемое вещество не оказывает мутагенного действия на испытуемые виды.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Растворитель/носитель:

- обоснование выбора растворителя/носителя,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Штаммы:

- используемые штаммы,

- количество клеток на культуру,

- деформационные характеристики.

Условия испытаний:

- количество тестируемого вещества на чашку (мг/планшет или мкл/планшет) с обоснованием выбора дозы и количества чашек на концентрацию,

- используемые средства массовой информации,

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости,

- лечебные процедуры.

Полученные результаты:

- признаки токсичности,

- признаки осадков,

- индивидуальный подсчет тарелок,

- среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение,

- взаимосвязь «доза-реакция», где это возможно,

- статистический анализ, если таковой имеется,

- одновременные отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями,

- исторические отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Эймс Б.Н., Макканн Дж. и Ямасаки Э. (1975), Методы обнаружения канцерогенов и мутагенов с помощью теста на мутагенность сальмонеллы/микросом млекопитающих, Mutation Res., 31, стр. 347-364.

(2) Марон Д.М. и Эймс Б.Н. (1983), Пересмотренные методы теста на мутагенность сальмонелл, Mutation Res., 113, стр. 173-215.

(3) Гейтхаус Д., Хаворт С., Себула Т., Гокке Э., Кир Л., Мацусима Т., Мельсион К., Номи Т., Венитт С. и Зейгер, E. (1994), Рекомендации по проведению анализов бактериальных мутаций, Mutation Res., 312, стр. 217-233.

(4) Кир, Л.Д., Брусик Д.Дж., Аулетта, А.Е., Фон Халле, Э.С., Браун, М.М., Симмон, В.Ф., Данкель, В., Макканн, Дж., Мортельманс, К., Привал, М., Рао, Т.К. и Рэй В. (1986), Salmonella typhimurium/Микросомальный анализ млекопитающих: отчет Программы Ген-Токс Агентства по охране окружающей среды США, Mutation Res., 168, стр. 69-240.

(5) Яхаги Т., М. Дегава, Ю. Ю. Сейно, Т. Мацусима, М. Нагао, Т. Сугимура и Ю. Хашимото (1975), Мутагенность канцерогенных азокрасителей и их производных, Cancer Letters 1, стр. 91-9

(6) Мацушима М., Сугимура Т., Нагао М., Яхаги Т., Шираи А. и Савамура М. (1980), Факторы, модулирующие мутагенность микробных тестов, в: Краткосрочные тестовые системы для Обнаружение канцерогенов, под ред. Норпот К.Х. и Гарнер Р.К., Спрингер, Берлин-Гейдельберг-Нью-Йорк, стр. 273–285.

(7) Гейтхаус, Д.Г., Роуленд, И.Р., Уилкокс, П., Каллендер, Р.Д. и Фостер, Р. (1980), Анализы бактериальных мутаций, в: Основные тесты на мутагенность: UKEMS, часть 1, пересмотренная, под ред. Д. Дж. Киркланд, Издательство Кембриджского университета, стр. 13–61.

(8) Эшахер Х. У., Воллеб У. и Порше Л. (1987), Тест на мутагенность пищевых продуктов перед инкубацией в жидкости, Журнал «Безопасность пищевых продуктов», 8, стр. 167-177.

(9) Грин М.Х.Л., Мюриэл У.Дж. и Бриджес Б.А. (1976), Использование упрощенного флуктуационного теста для обнаружения низких уровней мутагенов, Mutation Res., 38, стр. 33-42.

(10) Хаббард С.А., Грин М.Х.Л., Гейтхаус Д. и Бриджес Дж.В. (1984), Тест на флуктуацию бактерий, в: Справочник по процедурам испытаний на мутагенность, 2-е издание, изд. Килби, Б.Дж., Легатор, М., Николс, В. и Рамель, К., Эльзевир, Амстердам-Нью-Йорк-Оксфорд, стр. 101-111. 141-1

(11) Томпсон, Э.Д. и Мелампи, П.Дж. (1981), Исследование количественного суспензионного анализа мутагенеза со штаммами Salmonella typhimurium, Экологический мутагенез, 3, стр. 453-465.

(12) Араки А., Ногучи Т., Като Ф. и Мацусима Т. (1994), Улучшенный метод тестирования мутагенности газообразных соединений с использованием мешка для отбора проб газа, Mutation Res., 307, стр. 335 -344.

(13) Привал, М.Дж., Белл, С.Дж., Митчелл, В.Д., Рейперт, М.Д. и Воган, В.Л. (1984), Мутагенность бензидина и красителей, родственных бензидину, и выбранных моноазокрасителей в модифицированном анализе на сальмонеллу, Mutation Res., 136, стр. 33-47.

(14) Зейгер Э., Андерсон Б.Е., Хаворт С., Лоулор Т. и Мортелманс К. (1992), Тесты на мутагенность сальмонеллы. V. Результаты испытаний 311 химикатов, Environ. Мол. Мутаген., 19, стр. 2-141.

(15) Симмон В., Кауханен К. и Тардифф Р.Г. (1977), Мутагенная активность химических веществ, выявленных в питьевой воде, прогресс в области генетической токсикологии, Д. Скотт, Б. Бриджес и Ф. Собелс (ред. ) Elsevier, Амстердам, стр. 249–258.

(16) Хьюз Т.Дж., Симмонс Д.М., Монтейт И.Г. и Клакстон Л.Д. (1987), Метод испарения для измерения мутагенной активности летучих органических химикатов в анализе Эймса/Сальмонеллы, Экологический мутагенез, 9, стр. 421-441.

(17) Мацусима Т., Мацумото А., Шираи М., Савамура М. и Сугимура Т. (1979), Мутагенность встречающегося в природе канцерогена циказина и синтетических конъюгатов метилазоксиметана в Salmonella typhimurium, Cancer Res. ., 39, стр. 3780-3782.

(18) Тамура Г., Голд К., Ферро-Луцци А. и Эймс Б.Н. (1980), Фекалаза: модель активации диетических гликозидов мутагенами кишечной флорой, Proc. Натл. акад. наук. США, 77, стр. 4961–4965.

(19) Уилкокс П., Найду А., Уэдд Д.Дж. и Гейтхаус Д.Г. (1990), Сравнение Salmonella typhimurium TA 102 со штаммами Escherichia coli WP2 Tester, Mutagenesis, 5, стр. 285-291.

(20) Мацусима Т., Савамура М., Хара К. и Сугимура Т. (1976), Безопасный заменитель полихлорированных бифенилов в качестве индуктора или систем метаболической активации, в: Метаболическая активация in vitro в тестировании мутагенеза, ред. FJ de Serres et al. Эльзевир, Северная Голландия, стр. 85–88.

(21) Эллиот Б.М., Комбс Р.Д., Элкомб К.Р., Гейтхаус Д.Г., Гибсон Г.Г., Маккей Дж.М. и Вольф Р.К. (1992), Альтернативы S9, индуцированному Aroclor 1254, в анализах генотоксичности in vitro, Мутагенез, 7 , стр. 175-177.

(22) Марон Д., Каценелленбоген Дж. и Эймс Б. Н. (1981), Совместимость органических растворителей с тестом на сальмонеллу/микросомы, Mutation Res., 88, стр. 343-350.

(23) Клэкстон Л.Д., Аллен Дж., Аулетта А., Мортелманс К., Нестманн Э. и Зейгер Э. (1987), Руководство по тестам Salmonella typhimurium/микросом млекопитающих на бактериальную мутагенность, мутации Res ., 189, с. 83-91.

(24) Махон, Г.А.Т., Грин, М.Х.Л., Миддлтон, Б., Митчел, И., Робинсон, В.Д. и Твитс, Д.Дж. (1989), Анализ данных анализа микробных колоний, в: Подкомитет UKEMS по рекомендациям по мутагенности. Тестирование, часть II. Статистическая оценка данных испытаний на мутагенность / Под ред. Киркланд, диджей, издательство Кембриджского университета, стр. 28–65».

ПРИЛОЖЕНИЕ 4Е

«B.17. МУТАГЕННОСТЬ – ТЕСТ НА МУТАЦИЮ ГЕНА КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VITRO

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 476, Тест на мутацию гена клеток млекопитающих in vitro (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Тест на мутацию генов клеток млекопитающих in vitro можно использовать для обнаружения мутаций генов, вызванных химическими веществами. Подходящие клеточные линии включают клетки лимфомы мыши L5178Y, линии CHO, CHO-AS52 и V79 клеток китайского хомячка и лимфобластоидные клетки человека TK6 (1). В этих клеточных линиях наиболее часто используемые генетические конечные точки измеряют мутацию тимидинкиназы (ТК) и гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), а также трансгена ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (XPRT). Тесты на мутации TK, HPRT и XPRT выявляют различные спектры генетических событий. Аутосомное расположение TK и XPRT может позволить обнаруживать генетические события (например, большие делеции), не обнаруживаемые в локусе HPRT на Х-хромосомах (2)(3)(4)(5)(6).

В тесте на мутацию гена клеток млекопитающих in vitro можно использовать культуры существующих клеточных линий или клеточных штаммов. Используемые клетки отбираются на основе способности к росту в культуре и стабильности частоты спонтанных мутаций.

Тесты, проводимые in vitro, обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации. Эта система метаболической активации не может полностью имитировать условия in vivo млекопитающих. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать условий, которые могут привести к получению результатов, не отражающих внутреннюю мутагенность. Положительные результаты, которые не отражают внутреннюю мутагенность, могут быть результатом изменений pH, осмоляльности или высокого уровня цитотоксичности (7).

Этот тест используется для выявления возможных мутагенов и канцерогенов млекопитающих. Многие соединения, показавшие положительный результат в этом тесте, являются канцерогенами для млекопитающих; однако не существует идеальной корреляции между этим тестом и канцерогенностью. Корреляция зависит от химического класса, и появляется все больше свидетельств того, что существуют канцерогены, которые не обнаруживаются с помощью этого теста, поскольку они, по-видимому, действуют посредством других, негенотоксических механизмов или механизмов, отсутствующих в бактериальных клетках (6).

См. также Общее введение, часть B:

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Прямая мутация: мутация гена родительского типа мутантной формы, которая приводит к изменению или потере ферментативной активности функции кодируемого белка.

Мутагены замены пар оснований: вещества, вызывающие замену одной или нескольких пар оснований в ДНК.

Мутагены сдвига рамки: вещества, которые вызывают добавление или удаление одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.

Время фенотипической экспрессии: период, в течение которого неизмененные генные продукты истощаются из вновь мутировавших клеток.

Частота мутантов: количество наблюдаемых мутантных клеток, деленное на количество жизнеспособных клеток.

Относительный общий рост: увеличение количества клеток с течением времени по сравнению с контрольной популяцией клеток; рассчитывают как произведение роста суспензии относительно отрицательного контроля на эффективность клонирования относительно отрицательного контроля.

Относительный рост суспензии: увеличение количества клеток в течение периода экспрессии относительно отрицательного контроля.

Жизнеспособность: эффективность клонирования обработанных клеток во время посева в селективных условиях после периода экспрессии.

Выживаемость: эффективность клонирования обработанных клеток при посеве в конце периода лечения; выживаемость обычно выражается в отношении выживаемости контрольной популяции клеток.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Клетки, дефицитные по тимидинкиназы (ТК) вследствие мутации ТК+/- ТК-/-, устойчивы к цитотоксическому действию аналога пиримидина трифтортимидина (ТФТ). Клетки, владеющие тимидинкиназой, чувствительны к TFT, который вызывает ингибирование клеточного метаболизма и останавливает дальнейшее деление клеток. Таким образом, мутантные клетки способны пролиферировать в присутствии TFT, тогда как нормальные клетки, содержащие тимидинкиназу, этого не делают. Аналогично, клетки, дефицитные по HPRT или XPRT, отбираются по устойчивости к 6-тиогуанину (TG) или 8-азагуанину (AG). Свойства тестируемого вещества следует тщательно учитывать, если базовый аналог или соединение, родственное селективному агенту, тестируется в любом из тестов на мутацию гена клеток млекопитающих. Например, следует расследовать любую предполагаемую селективную токсичность тестируемого вещества для мутантных и немутантных клеток. Таким образом, эффективность системы/агента селекции должна быть подтверждена при тестировании химических веществ, структурно родственных селективному агенту (8).

Клетки в суспензионной или монослойной культуре подвергают воздействию тестируемого вещества, как с метаболической активацией, так и без нее, в течение подходящего периода времени и субкультивируют для определения цитотоксичности и обеспечения фенотипической экспрессии перед отбором мутантов (9) (10) (11) ( 12) (13). Цитотоксичность обычно определяют путем измерения относительной эффективности клонирования (выживаемости) или относительного общего роста культур после периода лечения. Обработанные культуры выдерживают в питательной среде в течение достаточного периода времени, характерного для каждого выбранного локуса и типа клеток, чтобы обеспечить почти оптимальную фенотипическую экспрессию индуцированных мутаций. Частоту мутантов определяют путем посева известного количества клеток в среду, содержащую селективный агент, для обнаружения мутантных клеток и в среду без селективного агента для определения эффективности клонирования (жизнеспособности). По истечении подходящего времени инкубации подсчитывают колонии. Частоту мутантов получают из количества мутантных колоний в селективной среде и количества колоний в неселективной среде.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Клетки

Для использования в этом тесте доступны различные типы клеток, включая субклоны клеток L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 или TK6. Типы клеток, используемые в этом тесте, должны иметь продемонстрированную чувствительность к химическим мутагенам, высокую эффективность клонирования и стабильную частоту спонтанных мутантов. Клетки следует проверять на предмет контаминации микоплазмой, и в случае контаминации их не следует использовать.

Тест должен быть разработан таким образом, чтобы иметь заданную чувствительность и мощность. Количество клеток, культур и концентрации используемого тестируемого вещества должны отражать эти определенные параметры (14). Минимальное количество жизнеспособных клеток, выживающих после лечения и используемых на каждом этапе теста, должно основываться на частоте спонтанных мутаций. Общее правило — использовать количество клеток, которое как минимум в 10 раз превышает частоту спонтанных мутаций. Однако рекомендуется использовать не менее 106 ячеек. Должны быть доступны адекватные исторические данные об используемой клеточной системе, чтобы указать на стабильные результаты теста.

1.4.1.2. Медиа и культурные условия

Следует использовать соответствующие питательные среды и условия инкубации (культивационные сосуды, температура, концентрация CO2 и влажность). Среду следует выбирать в соответствии с селективными системами и типом клеток, использованными в тесте. Особенно важно выбирать условия культивирования, обеспечивающие оптимальный рост клеток в период экспрессии и колониеобразующую способность как мутантных, так и немутантных клеток.

1.4.1.3. Подготовка культур

Клетки размножают из исходных культур, высевают в культуральную среду и инкубируют при 37°С. Перед использованием в этом тесте культуры, возможно, потребуется очистить от ранее существовавших мутантных клеток.

1.4.1.4. Метаболическая активация

Клетки должны подвергаться воздействию тестируемого вещества как при наличии, так и при отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Наиболее часто используемой системой является постмитохондриальная фракция с добавлением кофактора (S9), полученная из печени грызунов, обработанных агентами, индуцирующими ферменты, такими как Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) или комбинацией фенобарбитона. и β-нафтофлавон (19) (20).

Постмитохондриальную фракцию обычно используют в концентрациях в диапазоне 1-10% об./об. в конечной тестируемой среде. Выбор и состояние системы метаболической активации могут зависеть от класса тестируемого химического вещества. В некоторых случаях может оказаться целесообразным использовать более одной концентрации постмитохондриальной фракции.

Ряд разработок, включая создание генетически модифицированных клеточных линий, экспрессирующих специфические активирующие ферменты, могут обеспечить потенциал эндогенной активации. Выбор используемых клеточных линий должен быть научно обоснован (например, значимостью изофермента цитохрома Р450 для метаболизма тестируемого вещества).

1.4.1.5. Приготовление тестируемого вещества

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед обработкой клеток. Жидкие тестовые вещества можно добавлять непосредственно в тест-системы и/или разбавлять перед обработкой. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом и должен быть совместим с выживанием клеток и активностью S9. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подтверждено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя. При испытании неустойчивых к воде веществ используемые органические растворители не должны содержать воды. Воду можно удалить, добавив молекулярное сито.

1.4.2.2. Концентрации воздействия

Среди критериев, которые следует учитывать при определении наивысшей концентрации, — цитотоксичность, растворимость в тест-системе и изменения pH или осмоляльности.

Цитотоксичность следует определять с метаболической активацией и без нее в основном эксперименте, используя соответствующие показатели целостности и роста клеток, такие как относительная эффективность клонирования (выживаемость) или относительный общий рост. Может быть полезно определить цитотоксичность и растворимость в предварительном эксперименте.

Следует использовать не менее четырех анализируемых концентраций. При наличии цитотоксичности эти концентрации должны охватывать диапазон от максимальной до незначительной токсичности или отсутствия токсичности; обычно это означает, что уровни концентрации должны различаться не более чем на коэффициент от 2 до [радик]10. Если максимальная концентрация основана на цитотоксичности, то она должна приводить к относительной выживаемости примерно 10-20 % (но не менее 10 %) (относительной эффективности клонирования) или относительному общему росту. Для относительно нецитотоксичных веществ максимальная тестируемая концентрация должна составлять 5 мг/мл, 5 мкл/мл или 1,01 М, в зависимости от того, какая из них ниже.

Относительно нерастворимые вещества следует тестировать до предела растворимости или выше него в условиях культивирования. Признаки нерастворимости следует определять в окончательной обрабатывающей среде, воздействию которой подвергаются клетки. Может быть полезно оценить растворимость в начале и в конце лечения, поскольку растворимость может меняться в ходе воздействия в тест-системе из-за присутствия клеток, S9, сыворотки и т. д. Нерастворимость можно обнаружить невооруженным глазом. . Осадок не должен мешать подсчету очков.

1.4.2.3. Элементы управления

В каждый эксперимент следует включать одновременные положительные и отрицательные контроли (растворитель или носитель), как с метаболической активацией, так и без нее. При использовании метаболической активации химическое вещество положительного контроля должно быть тем, которое требует активации для получения мутагенного ответа.

Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Могут быть использованы другие соответствующие эталонные вещества положительного контроля, например если в лаборатории имеется база исторических данных по 5-бром-2'-дезоксиуридину (№ CAS 59-14-3, № Einecs 200-415-9), можно также использовать это эталонное вещество. Следует рассмотреть возможность использования химических веществ положительного контроля, соответствующих химическому классу, если таковые имеются.

Отрицательные контроли, состоящие только из растворителя или носителя в обрабатывающей среде и обработанные так же, как и группы обработки, должны быть включены. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, если нет исторических данных по контролю, демонстрирующих, что выбранный растворитель не вызывает никаких вредных или мутагенных эффектов.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Лечение тестируемым веществом

Пролиферирующие клетки следует подвергать воздействию тестируемого вещества как с метаболической активацией, так и без нее. Воздействие должно осуществляться в течение подходящего периода времени (обычно эффективно 3-6 часов). Время воздействия может быть продлено на один или несколько клеточных циклов.

В каждой тестируемой концентрации можно использовать как дубликаты, так и однократно обработанные культуры. При использовании отдельных культур количество концентраций следует увеличить, чтобы обеспечить достаточное количество культур для анализа (например, не менее восьми анализируемых концентраций). Следует использовать дубликаты отрицательных (растворяющих) контрольных культур.

Газообразные или летучие вещества следует проверять соответствующими методами, например, в герметичных культуральных сосудах (21) (22).

1.4.3.2. Измерение выживаемости, жизнеспособности и частоты мутантов

В конце периода воздействия клетки промывают и культивируют для определения выживаемости и обеспечения экспрессии мутантного фенотипа. Измерение цитотоксичности путем определения относительной эффективности клонирования (выживаемости) или относительного общего роста культур обычно начинают после периода лечения.

Для каждого локуса установлено определенное минимальное время, необходимое для обеспечения почти оптимальной фенотипической экспрессии вновь индуцированных мутантов (HPRT и XPRT требуют по меньшей мере 6-8 дней, а TK - по меньшей мере двух дней). Клетки выращивают в среде с селективным агентом(ами) и без него для определения количества мутантов и эффективности клонирования соответственно. Измерение жизнеспособности (используемое для расчета частоты мутантов) начинается в конце времени экспрессии путем посева в неселективную среду.

Если тестируемое вещество дает положительный результат в тесте L5178Y TK+/-, определение размера колонии следует провести по крайней мере на одной из тестовых культур (самая высокая положительная концентрация), а также на отрицательном и положительном контролях. Если тестируемое вещество дает отрицательный результат в тесте L5178Y TK+/-, определение размера колоний следует провести на отрицательном и положительном контролях. В исследованиях с использованием TK6TK+/- также можно определить размер колонии.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные должны включать определение цитотоксичности и жизнеспособности, количество колоний и частоту мутантов для обработанных и контрольных культур. В случае положительного ответа в тесте L5178Y TK+/- колонии оценивают с использованием критериев малых и больших колоний по крайней мере по одной концентрации тестируемого вещества (наивысшая положительная концентрация), а также по отрицательному и положительному контролю. Молекулярная и цитогенетическая природа мутантов как больших, так и малых колоний подробно изучена (23) (24). В тесте TK+/- колонии оцениваются по критериям нормального роста (крупные) и медленного роста (маленькие) колоний (25). Мутантные клетки, подвергшиеся наиболее обширным генетическим повреждениям, имеют увеличенное время удвоения и, таким образом, образуют небольшие колонии. Масштаб этого повреждения обычно варьируется от потери всего гена до кариотипически видимых хромосомных аберраций. Индукция небольших мутантов колоний связана с химическими веществами, вызывающими грубые хромосомные аберрации (26). Менее серьезно пораженные мутантные клетки растут со скоростью, аналогичной родительским клеткам, и образуют большие колонии.

Должны быть указаны выживаемость (относительная эффективность клонирования) или относительный общий рост. Частоту мутантов следует выражать как количество мутантных клеток на количество выживших клеток.

Должны быть предоставлены индивидуальные данные по культуре. Кроме того, все данные должны быть сведены в табличную форму.

Нет необходимости проверять четкий положительный ответ. Сомнительные результаты следует уточнять путем дальнейшего тестирования, желательно с модификацией условий эксперимента. Отрицательные результаты необходимо подтверждать в каждом конкретном случае. В тех случаях, когда подтверждение отрицательных результатов не считается необходимым, должно быть предоставлено обоснование. Модификацию параметров исследования для расширения диапазона оцениваемых условий следует рассматривать в последующих экспериментах в случае сомнительных или отрицательных результатов. Параметры исследования, которые могут быть изменены, включают интервал концентраций и условия метаболической активации.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев для определения положительного результата, таких как увеличение, связанное с концентрацией, или воспроизводимое увеличение частоты мутантов. В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний. Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа.

Тестируемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этой системе.

Хотя большинство исследований дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности тестируемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительные результаты теста на мутацию генов клеток млекопитающих in vitro указывают на то, что тестируемое вещество индуцирует генные мутации в используемых культивируемых клетках млекопитающих. Положительная реакция концентрации, которая является воспроизводимой, является наиболее значимой. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытания испытуемое вещество не вызывает генных мутаций в используемых культивируемых клетках млекопитающих.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Растворитель/носитель:

- обоснование выбора носителя/растворителя,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Ячейки:

- тип и источник клеток,

- количество клеточных культур,

- количество клеточных пассажей, если применимо,

- методы поддержания культуры клеток, если применимо,

- отсутствие микоплазмы.

Условия испытаний:

- обоснование выбора концентраций и количества культур, включая, например, данные о цитотоксичности и ограничениях растворимости, если таковые имеются,

- состав среды, концентрация CO2,

- концентрация испытуемого вещества,

- добавленный объем растворителя и испытуемого вещества,

- температура инкубации,

- время инкубации,

- продолжительность лечения,

- плотность клеток во время лечения,

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости,

- положительный и отрицательный контроль,

- продолжительность периода экспрессии (включая количество засеянных клеток, а также субкультур и графики кормления, если применимо),

- селективные агенты,

- критерии признания тестов положительными, отрицательными или сомнительными,

- методы, используемые для подсчета количества жизнеспособных и мутантных клеток,

- определение колоний, размер и тип которых учитываются (включая критерии для «маленьких» и «крупных» колоний, в зависимости от обстоятельств).

Полученные результаты:

- признаки токсичности,

- признаки осадков,

- данные о pH и осмоляльности во время воздействия испытуемого вещества, если они определены,

- размер колонии, если оцениваться по крайней мере по отрицательному и положительному контролю,

- способность лаборатории обнаруживать мутанты небольших колоний с помощью системы L5178Y TK+/-, где это возможно,

- взаимосвязь «доза-реакция», где это возможно,

- статистический анализ, если таковой имеется,

- одновременные отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные,

- исторические отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями,

- частота мутанта.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Мур, М.М., ДеМарини, Д.М., ДеСеррес, Ф.Дж. и Тиндал, К.Р. (ред.) (1987), Отчет Банбери 28; Мутагенез клеток млекопитающих, Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

(2) Чу, E.H.Y. и Маллинг Х.В. (1968), Генетика клеток млекопитающих. II. Химическая индукция специфических локусных мутаций в клетках китайского хомячка in vitro, Proc. Натл. акад. наук. США, 61, стр. 101–1. 1306-1

(3) Либер, Х.Л. и Тилли, В.Г. (1982), Анализ мутаций в локусе тимидинкиназы в диплоидных лимфобластах человека, Mutation Res. 94, стр. 467-485.

(4) Мур, М.М., Харингтон-Брок, К., Дорр, К.Л. и Дирфилд, К.Л. (1989), Дифференциальное количественное определение мутантов в локусах мышиной лимфомы TK и CHO HGPRT, Mutagenesis, 4, стр. 394-403.

(5) Аарон К.С. и Станковски-младший Л.Ф. (1989), Сравнение анализов AS52/XPRT и CHO/HPRT: оценка шести кандидатов на лекарственные средства, мутации Res. 223, стр. 121-128.

(6) Аарон К.С., Болксфолди Г., Глатт Х.Р., Мур М., Ниши Ю., Станковски младший Л.Ф., Тайсс Дж. и Томпсон Э. (1994), Анализы мутаций генов клеток млекопитающих Отчет рабочей группы. Отчет Международного семинара по стандартизации процедур испытаний на генотоксичность. Мутация Рез. 312, стр. 235-239.

(7) Скотт Д., Галлоуэй С.М., Маршалл Р.Р., Ишидате М., Брусик Д., Эшби Дж. и Мир Б.С. (1991), Генотоксичность в экстремальных условиях культивирования. Отчет целевой группы 9 ICPEMC, Mutation Res. 257, стр. 147-204.

(8) Клайв Д., МакКуэн Р., Спектор Дж. Ф. С., Пайпер К. и Маворнин К. Х. (1983), Специфические генные мутации в клетках L5178Y в культуре. Отчет Программы Gene-Tox Агентства по охране окружающей среды США, Mutation Res., 115, стр. 225–251.

(9) Ли А.П., Гупта Р.С., Хефлих Р.Х. и Уоссон Дж.С. (1988), Обзор и анализ системы яичников китайского хомяка/гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы для определения мутагенности химических агентов: отчет о фазе III Программы Gene-Tox Агентства по охране окружающей среды США, Mutation Res., 196, стр. 17–36.

(10) Ли, А.П., Карвер, Дж.Х., Чой, В.Н., Се, А.В., Гупта, Р.С., Лавдей, К.С., ОНил, Дж.П., Риддл, Дж.К., Станковски, Л.Ф.младший и Ян, Л.Л. (1987), Путеводитель для проведения анализа мутации гена клеток яичника китайского хомяка/гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы, Mutation Res., 189, стр. 135-141.

(11) Либер Х.Л., Янделл Д.В. и Литтл Дж.Б. (1989), Сравнение индукции мутаций в локусах TK и HPRT в лимфобластоидных клетках человека: количественные различия обусловлены дополнительным классом мутаций в аутосомном локусе TK, Mutation Res., 216, стр. 9–17.

(12) Станковски, Л. Ф. младший, Тиндал, К. Р. и Хси, А. В. (1986), Количественный и молекулярный анализ этилметаносульфоната - и ICR 191-индуцированные молекулярные анализы этилметаносульфоната - и ICR 191 индуцированные мутации в клетках AS52, Mutation Res., 160, стр. 133-147.

(13) Тернер Н.Т., Бэтсон А.Г. и Клайв Д. (1984), Процедура анализа мутагенности клеток лимфомы мыши L5178Y/TK+/- - TK+/-, в: Kilbey, B.J. et al (ред.), Справочник по Процедуры испытаний на мутагенность, издательство Elsevier Science Publishers, Нью-Йорк, стр. 239-268.

(14) Арлетт К.Ф., Смит Д.М., Кларк Г.М., Грин М.Х.Л., Коул Дж., МакГрегор Д.Б. и Асквит С.К. (1989), Анализы мутаций генов клеток млекопитающих, основанные на формировании колоний, в: Статистическая оценка мутагенности. Данные испытаний, Киркланд, Д.Дж., изд., Издательство Камберджского университета, стр. 66–101.

(15) Аббондандоло А., Бонатти С., Корти Г., Фиорио Р., Лоприено Н. и Маццаккоро А. (1977), Индукция мутантов, устойчивых к 6-тиогуанину, в клетках китайского хомячка V79 с помощью Активированный микросомами печени мыши диметилнитрозамин, мутация Res. 46, стр. 365-373.

(16) Эймс Б.Н., Макканн Дж. и Ямасаки Э. (1975), Методы обнаружения канцерогенов и мутагенов с помощью теста на мутагенность сальмонеллы/микросом млекопитающих, Mutation Res. 31, стр. 347–364.

(17) Клайв Д., Джонсон К.О., Спектор Дж.Ф.С., Батсон А.Г. и Браун М.М.М. (1979), Проверка и характеристика системы анализа мутагена лимфомы L5178Y/TK+/- - мыши, Mutat. Рез. 59, стр. 61–108.

(18) Марон Д.М. и Эймс Б.Н. (1983), Пересмотренные методы теста на мутагенность сальмонелл, Mutation Res. 113, стр. 173-215.

(19) Эллиотт, Б.М., Комбс, Р.Д., Элкомб, К.Р., Гейтхаус, Д.Г., Гибсон, Г.Г., Маккей, Дж.М. и Вольф, Р.К. (1992), Альтернативы индуцированному Aroclor 1254 S9 в: Анализы генотоксичности in vitro, Мутагенез 7 , стр. 175-177.

(20) Мацушима Т., Савамура М., Хара К. и Сугимура Т. (1976), Безопасный заменитель полихолринированных дифенилов как индуктор систем метаболической активации, в: Метаболическая активация in vitro при тестировании мутагенеза, де Серрес, Ф.Дж., Фаутс, Дж.Р., Бенд, Дж.Р. и Филпот, Р.М. (редакторы), Elsevier, Северная Голландия, стр. 85-88.

(21) Кран, Д.Ф., Барский, Ф.К. и МакКуи, К.Т. (1982), Анализ мутации CHO/HGPRT: оценка газов и летучих жидкостей, в: Тикк, Р.Р., Коста, Д.Л., Шайх, К.М. (ред.), Генотоксические эффекты агентов воздушно-десантных войск, Нью-Йорк, Пленум, стр. 91–103.

(22) Самора, П.О., Бенсон, Дж.М., Ли, А.П. и Брукс, А.Л. (1983), Оценка системы воздействия с использованием клеток, выращенных на коллагеновых гелях, для обнаружения высоколетучих мутагенов в анализе мутаций CHO/HGPRT, Экологический мутагенез, 5 , стр. 795-801.

(23) Эпплгейт, М.Л., Мур, М.М., Бродер, С.Б., Баррелл, А. и Хозиер, Дж.К. (1990), Молекулярное рассечение мутаций в гетерозиготном локусе тимидинкиназы в клетках лимфомы мыши, Proc. Натл. акад. наук. США, 87, стр. 51-55.

(24) Мур, М.М., Клайв, Д. Хозиер, Дж.К., Ховард, Б.Е., Бэтсон, А.Г., Тернер, Н.Т. и Сойер, Дж. (1985), Анализ резистентных к трифлуронтимидину (TFT+) мутантов L5178Y/TK+/- - Мышиные лимфомные клетки, мутация Res. 151, стр. 161-174.

(25) Янделл Д.В., Дрия Т.П. и Литтл Дж.Б. (1990), Молекулярно-генетический анализ рецессивных мутаций в гетерозиготном аутосомном локусе в клетках человека, Mutation Res. 229, стр. 89-102.

(26) Мур, М.М. и Доерр, К.Л. (1990), Сравнение частоты хромосомных аберраций и частоты мутантов с дефицитом ТК в небольших колониях в клетках лимфомы мыши L5178Y/TK+/- - 3.7.2C, Мутагенез, 5, стр. 609-614. ."

ПРИЛОЖЕНИЕ 4F

«B.23. ТЕСТ НА сперматогониальные хромосомные аберрации млекопитающих.

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 483, Тест на сперматогониальные хромосомные аберрации млекопитающих (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью теста на аберрацию сперматогониальных хромосом млекопитающих in vivo является выявление тех веществ, которые вызывают структурные хромосомные аберрации в сперматогониальных клетках млекопитающих (1) (2) (3) (4) (5). Структурные аберрации могут быть двух типов: хромосомные и хроматидные. У большинства химических мутагенов индуцируются аберрации хроматидного типа, но встречаются и аберрации хромосомного типа. Этот метод не предназначен для измерения числовых аберраций и обычно не используется для этой цели. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной многих генетических заболеваний человека.

Этот тест измеряет хромосомные события в сперматогониальных зародышевых клетках и, следовательно, ожидается, что он будет прогнозировать индукцию наследственных мутаций в зародышевых клетках.

В этом тесте обычно используются грызуны. Этот цитогенетический тест in vivo выявляет хромосомные аберрации в сперматогониальных митозах. Другие клетки-мишени не являются объектом данного метода.

Чтобы обнаружить аберрации хроматидного типа в сперматогониальных клетках, следует исследовать первое митотическое деление клеток после лечения до того, как эти поражения исчезнут при последующих делениях клеток. Дополнительную информацию об обработанных сперматогониальных стволовых клетках можно получить с помощью мейотического анализа хромосом на предмет аберраций хромосомного типа в диакинезе-метафазе I, когда обработанные клетки становятся сперматоцитами.

Этот тест in vivo предназначен для определения активности мутагенов соматических клеток в половых клетках. Кроме того, сперматогониальный тест важен для оценки опасности мутагенности, поскольку позволяет учитывать факторы метаболизма in vivo, фармакокинетику и процессы репарации ДНК.

В семенниках присутствует несколько поколений сперматогониев, обладающих различной чувствительностью к химической обработке. Таким образом, обнаруженные аберрации представляют собой совокупный ответ обработанных популяций сперматогониальных клеток, при этом преобладают более многочисленные дифференцированные сперматогониальные клетки. В зависимости от их положения в семеннике разные поколения сперматогониев могут или не могут попадать в общий кровоток из-за физического и физиологического барьера клеток Сертоли и гемато-тестикулярного барьера.

Если есть свидетельства того, что тестируемое вещество или реактивный метаболит не достигнет ткани-мишени, использовать этот тест нецелесообразно.

См. также «Общее введение», часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Аберрация хроматидного типа: структурное повреждение хромосом, выражающееся в разрыве одиночных хроматид или разрыве и воссоединении хроматид.

Аберрация хромосомного типа: структурное повреждение хромосомы, выражающееся в разрыве или разрыве и воссоединении обеих хроматид в одном и том же месте.

Разрыв: ахроматическое поражение размером меньше ширины одной хроматиды и с минимальным смещением хроматид.

Числовая аберрация: изменение числа хромосом по сравнению с нормальным числом, характерным для использованных животных.

Полиплоидия: число гаплоидных хромосом (n), кратное диплоидному числу (т. е. 3n, 4n и т. д.).

Структурная аберрация: изменение структуры хромосом, обнаруживаемое при микроскопическом исследовании метафазной стадии деления клеток, наблюдаемое в виде делеций, внутри- или взаимообменов.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

Животных подвергают воздействию тестируемого вещества подходящим путем и умерщвляют в соответствующее время после лечения. Перед умерщвлением животных обрабатывают веществом, задерживающим метафазу (например, колхицином или Колцемидом®). Затем из зародышевых клеток изготавливают препараты хромосом и окрашивают их, а метафазные клетки анализируют на наличие хромосомных аберраций.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Выбор вида животных

Обычно используются самцы китайских хомяков и мышей. Однако можно использовать самцов других подходящих видов млекопитающих. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых взрослых животных. В начале исследования колебания веса животных должны быть минимальными и не превышать ±20 % от среднего веса.

1.4.1.2. Условия содержания и кормления

Применяются общие условия, указанные в Общем введении к Части B, хотя целевая влажность должна составлять 50–60 %.

1.4.1.3. Подготовка животных

Здоровые молодые взрослые мужчины случайным образом распределяются в контрольную и лечебную группы. Клетки должны быть расположены таким образом, чтобы возможные последствия их размещения были сведены к минимуму. Животные идентифицируются однозначно. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям не менее пяти дней до начала исследования.

1.4.1.4. Приготовление доз

Твердое тестируемое вещество следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и разбавить, если необходимо, перед введением дозы животным. Жидкие тестируемые вещества можно дозировать непосредственно или разбавлять перед дозированием. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен оказывать токсического воздействия при используемых дозах и не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подтверждено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя.

1.4.2.2. Элементы управления

В каждый тест следует включать одновременные положительные и отрицательные контроли (растворитель/носитель). За исключением обработки тестируемым веществом, с животными в контрольных группах следует обращаться так же, как с животными в обработанных группах.

Положительный контроль должен вызывать структурные хромосомные аберрации in vivo в сперматогониальных клетках при введении на уровнях воздействия, которые, как ожидается, дадут заметное увеличение по сравнению с фоном.

Положительные контрольные дозы следует выбирать так, чтобы эффект был очевиден, но не раскрывал сразу читателю идентичность закодированных слайдов. Допустимо, чтобы положительный контроль вводился способом, отличным от испытуемого вещества, и пробы отбирались только один раз. Кроме того, можно рассмотреть возможность использования химических веществ положительного контроля, соответствующих химическому классу, если таковые имеются. Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Отрицательные контроли, обработанные только растворителем или наполнителем и в остальном обработанные так же, как и группы лечения, должны быть включены для каждого времени отбора проб, если только исторические контрольные данные не демонстрируют приемлемую изменчивость между животными и частоту клеток с хромосомными аберрациями. Кроме того, следует также использовать необработанные контроли, за исключением случаев, когда имеются исторические или опубликованные данные по контролю, демонстрирующие, что выбранный растворитель/носитель не вызывает никаких вредных или мутагенных эффектов.

1,5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Количество животных

Каждая обработанная и контрольная группы должны включать не менее пяти поддающихся анализу самцов.

1.5.2. График лечения

Тестируемые вещества предпочтительно вводят один или два раза (т.е. за одну обработку или за две обработки). Тестируемые вещества также можно вводить в виде разделенной дозы, т.е. две обработки в один и тот же день с интервалом не более нескольких часов, чтобы облегчить введение большого объема материала. Другие режимы дозирования должны быть научно обоснованы.

В группе с самой высокой дозой используются два периода отбора проб после лечения. Поскольку тестируемое вещество может влиять на кинетику клеточного цикла, используют один ранний и один поздний период отбора проб примерно через 24 и 48 часов после обработки. Для доз, отличных от самой высокой, время отбора проб должно составлять 24 часа или 1,5 клеточного цикла после лечения, если только не известно, что другое время отбора проб более подходит для обнаружения эффектов (6).

Кроме того, могут использоваться другие времена выборки. Например, в случае химических веществ, которые могут вызывать отставание хромосом или оказывать S-независимые эффекты, может оказаться целесообразным более раннее время отбора проб (1).

Целесообразность повторного графика лечения необходимо определять в каждом конкретном случае. После повторной схемы лечения животных следует умерщвлять через 24 часа (продолжительность 1,5 клеточного цикла) после последней обработки. При необходимости можно использовать дополнительное время выборки.

Перед умерщвлением животным внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу вещества, задерживающего метафазу (например, Колцемид® или колхоцин). После этого через соответствующие промежутки времени у животных отбирают образцы. Для мышей этот интервал составляет примерно 3–5 часов, для китайских хомяков примерно 4–5 часов.

1.5.3. Уровни доз

Если исследование по определению диапазона проводится из-за отсутствия подходящих данных, его следует проводить в той же лаборатории с использованием тех же видов, штаммов и схемы лечения, которые использовались в основном исследовании (7). Если имеется токсичность, для первого отбора проб используются три уровня дозы. Эти уровни доз должны охватывать диапазон от максимальной до незначительной токсичности или отсутствия токсичности. В более позднее время отбора проб необходимо использовать только самую высокую дозу. Наивысшая доза определяется как вызывающие дозу признаки токсичности, при которых можно ожидать, что более высокие уровни дозы, основанные на том же режиме дозирования, приведут к летальному исходу.

Вещества со специфической биологической активностью в низких нетоксичных дозах (например, гормоны и митогены) могут быть исключениями из критериев установления дозы и должны оцениваться в каждом конкретном случае. Высшую дозу можно также определить как дозу, которая вызывает некоторые признаки токсичности в сперматогониальных клетках (например, снижение соотношения сперматогониальных митозов к первой и второй метафазам мейоза; это снижение не должно превышать 50%).

1.5.4. Предельный тест

Если тест на одном уровне дозы, по меньшей мере, 2000 мг/кг массы тела/день с использованием однократного лечения или двух курсов лечения в один и тот же день, не вызывает заметных токсических эффектов и если на основании данных структурных исследований не следует ожидать генотоксичности родственных веществ, то полное исследование с использованием трех уровней доз может не считаться необходимым. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня дозы в предельном испытании.

1.5.5. Введение доз

Тестируемое вещество обычно вводят через зонд с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли или путем внутрибрюшинной инъекции. Другие пути воздействия могут быть приемлемыми, если они оправданы. Максимальный объем жидкости, который можно вводить через зонд или путем инъекции за один раз, зависит от размера подопытного животного. Объем не должен превышать 2 мл/100 г массы тела. Использование объемов, превышающих эти, должно быть обосновано. За исключением раздражающих или разъедающих веществ, действие которых обычно усиливается при более высоких концентрациях, изменчивость объема испытания следует свести к минимуму путем регулирования концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.5.6. Подготовка хромосом

Сразу после умерщвления клеточные суспензии получают из одного или обоих семенников, подвергают воздействию гипотонического раствора и фиксируют. Затем клетки распределяют по предметным стеклам и окрашивают.

1.5.7. Анализ

Для каждого животного необходимо проанализировать не менее 100 хорошо распределенных метафаз (т.е. минимум 500 метафаз на группу). Это число можно уменьшить, если наблюдается большое количество аберраций. Все предметные стекла, включая положительные и отрицательные контроли, перед микроскопическим анализом должны быть независимо закодированы. Поскольку процедуры фиксации часто приводят к разрыву части метафаз с потерей хромосом, засчитываемые клетки должны содержать количество центромер, равное числу 2n ± 2.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные по отдельным животным должны быть представлены в табличной форме. Экспериментальная единица – животное. Для каждого отдельного животного следует оценить количество клеток со структурными хромосомными аберрациями и количество хромосомных аберраций на клетку. Различные типы структурных хромосомных аберраций должны быть перечислены с указанием их количества и частоты для обработанных и контрольных групп. Пропуски регистрируются отдельно и сообщаются, но обычно не включаются в общую частоту аберраций.

Если наблюдается митоз, а также мейоз, соотношение сперматогониальных митозов к первой и второй метафазам мейоза должно быть определено как мера цитотоксичности для всех обработанных животных и животных отрицательного контроля в общей выборке из 100 делящихся клеток на животное, чтобы установить возможную цитотоксичность. эффект. Если наблюдается только митоз, индекс митоза следует определять не менее чем в 1000 клетках для каждого животного.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существует несколько критериев определения положительного результата, таких как дозозависимое увеличение относительного количества клеток с хромосомными аберрациями или явное увеличение числа клеток с аберрациями при однократной дозе в одно время отбора проб. В первую очередь следует учитывать биологическую значимость результатов. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний (8). Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа. Сомнительные результаты следует уточнить путем дальнейшего тестирования, предпочтительно с использованием модификации экспериментальных условий.

Испытуемое вещество, результаты которого не соответствуют вышеуказанным критериям, считается немутагенным в этом тесте.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительные результаты теста на аберрацию сперматогониальных хромосом in vivo указывают на то, что тестируемое вещество вызывает структурные хромосомные аберрации в зародышевых клетках тестируемых видов. Отрицательные результаты указывают на то, что в условиях испытаний испытуемое вещество не вызывает хромосомных аберраций в зародышевых клетках испытуемых видов.

Следует обсудить вероятность того, что тестируемое вещество или его метаболиты достигнут ткани-мишени.

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Растворитель/носитель:

- обоснование выбора транспортного средства,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Тестовые животные:

- используемый вид/штамм,

- количество и возраст животных,

- источник, жилищные условия, рацион и т.д.,

- индивидуальный вес животных в начале испытания, включая диапазон массы тела, среднее значение и стандартное отклонение для каждой группы.

Условия испытаний:

- данные исследования дальности, если оно завершено,

- обоснование выбора уровня дозы,

- обоснование пути введения,

- подробности приготовления тестируемого вещества,

- подробности введения испытуемого вещества,

- обоснование времени жертвования,

- преобразование концентрации исследуемого вещества в рационе/питьевой воде (ppm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела/день), если применимо,

- сведения о качестве продуктов питания и воды,

- подробное описание графиков обработки и отбора проб,

- методы измерения токсичности,

- личность вещества, задерживающего метафазу, его концентрация и продолжительность лечения,

- методы подготовки слайдов,

- критерии оценки аберраций,

- количество проанализированных клеток на животное,

- критерии признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными.

Полученные результаты:

- признаки токсичности,

- митотический индекс,

- соотношение клеток сперматогониальных митозов к первой и второй метафазам мейоза,

- вид и количество аберраций, указываются отдельно для каждого животного,

- общее количество аберраций на группу,

- количество клеток с аберрациями на группу,

- взаимосвязь «доза-реакция», если это возможно,

- статистический анализ, если таковой имеется,

- данные одновременного отрицательного контроля,

- исторические данные отрицательного контроля с диапазонами, средними значениями и стандартными отклонениями,

- данные одновременного положительного контроля,

- изменения плоидности, если они наблюдаются.

Обсуждение результатов.

Выводы.

4. ССЫЛКИ

(1) Адлер, И.Д., (1986), Кластогенный потенциал химических мутагенов в сперматогонии мышей, связанный с их характеристиками клеточного цикла, в: Генетическая токсикология химикатов окружающей среды, Часть B: Генетические эффекты и прикладной мутагенез, Рамель, К., Ламберт. , Б. и Магнуссон, Дж. (ред.) Лисс, Нью-Йорк, стр. 477–484.

(2) Адлер, И.Д., (1984), Цитогенетические тесты на млекопитающих, в: Тестирование мутагенности: практический подход, (ред.) С. Венитт и Дж. М. Парри, IRL Press, Оксфорд, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 275-306.

(3) Эванс, Э.П., Брекон, Г. и Форд, К.Е. (1964), Метод воздушной сушки мейотических препаратов из семенников млекопитающих, Цитогенетика и клеточная генетика, 3, стр. 289-294.

(4) Ричольд М., Эшби Дж., Чэндли А., Гейтхаус Д.Г. и Хендерсон Л. (1990), Цитогенетические анализы in vivo, в: DJ Kirkland (ред.), Основные тесты на мутагенность, рекомендовано UKEMS Процедуры. Подкомитет UKEMS по рекомендациям по испытаниям на мутагенность. Отчет. Пересмотренная часть I, издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 115–141.

(5) Ямамото К. и Кикучи Ю. (1978), Новый метод получения сперматогониальных хромосом млекопитающих, Mutation Res., 52, стр. 207-209.

(6) Адлер И.Д., Шелби М.Д., Бутман Дж., Фавор Дж., Дженерозо В., Пакьеротти Ф., Сибуя Т. и Танака Н. (1994), Международный семинар по стандартизации процедур испытаний на генотоксичность. . Сводный отчет Рабочей группы по тестам зародышевых клеток млекопитающих, Mutation Res., 312, стр. 313-318.

(7) Филдер, Р.Дж., Аллен, Дж.А., Бубис, А.Р., Ботам, П.А., Доу, Дж., Эсдейл, Д.Дж., Гейтхаус, Д.Г., Ходсон-Уокер, Г., Мортон, Д.Б., Киркланд, Д.Дж. и Ричолд, М. (1992), Отчет Рабочей группы Британского токсикологического общества/Британского общества по экологическим мутагенам: Установление дозы в анализах мутагенности in vivo, Мутагенез, 7, стр. 313-319.

(8) Ловелл Д.П., Андерсон Д., Альбанезе Р., Амфлетт Дж.Э., Кларк Г., Фергюсон Р., Ричольд М., Папворт Д.Г. и Сэвидж Дж.Р.К. (1989), Статистический анализ In Цитогенетические анализы Vivo, в: DJ Kirkland (ред.), Статистическая оценка данных испытаний на мутагенность. Подкомитет UKEMS по руководящим принципам испытаний на мутагенность, отчет, Часть III. Издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 184–232».

ПРИЛОЖЕНИЕ 4G

«B.39. ТЕСТ ВНЕПЛАННОГО СИНТЕЗА ДНК (UDS) НА КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO

1. МЕТОД

Этот метод является копией OECD TG 486, Тест на внеплановый синтез ДНК (UDS) с клетками печени млекопитающих in vivo (1997).

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Целью теста внепланового синтеза ДНК (UDS) с клетками печени млекопитающих in vivo является идентификация тестируемых веществ, которые индуцируют репарацию ДНК в клетках печени обработанных животных (1), (2), (3), (4).

Этот тест in vivo представляет собой метод исследования генотоксического воздействия химических веществ на печень. Измеренная конечная точка указывает на повреждение ДНК и последующее восстановление в клетках печени. Печень обычно является основным местом метаболизма всасываемых соединений. Таким образом, это подходящее место для измерения повреждений ДНК in vivo.

Если есть свидетельства того, что тестируемое вещество не достигнет целевой ткани, использовать этот тест нецелесообразно.

Конечную точку незапланированного синтеза ДНК (UDS) измеряют путем определения поглощения меченых нуклеозидов клетками, которые не подвергаются запланированному (S-фазе) синтезу ДНК. Наиболее широко используемым методом является определение поглощения меченного тритием тимидина (3H-TdR) методом авторадиографии. Печень крыс предпочтительно используют для тестов UDS in vivo. Можно использовать и другие ткани, кроме печени, но они не являются объектом данного метода.

Обнаружение ответа UDS зависит от количества оснований ДНК, вырезанных и замененных в месте повреждения. Таким образом, тест UDS особенно ценен для выявления вызванного веществом «длинного патча» (от 20 до 30 оснований). Напротив, «короткое восстановление» (от одного до трех оснований) обнаруживается с гораздо меньшей чувствительностью. Кроме того, мутагенные события могут возникнуть из-за невосстановления, неправильного восстановления или неправильной репликации повреждений ДНК. Степень реакции UDS не дает никаких указаний на точность процесса ремонта. Кроме того, возможно, что мутаген вступает в реакцию с ДНК, но повреждение ДНК не восстанавливается с помощью процесса эксцизионной репарации. Отсутствие конкретной информации о мутагенной активности, обеспечиваемой тестом UDS, компенсируется потенциальной чувствительностью этой конечной точки, поскольку она измеряется во всем геноме.

См. также «Общее введение», часть B.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Клетки в ремонте: чистое ядерное зерно (NNG) выше заданного значения, которое должно быть подтверждено лабораторией, проводящей испытание.

Чистые ядерные зерна (NNG): количественная мера активности UDS клеток в авторадиографических тестах UDS, рассчитываемая путем вычитания среднего количества цитоплазматических зерен в эквивалентных ядру цитоплазматических областях (CG) из числа ядерных зерен (NG): NNG = NG. - КГ. Количество NNG рассчитывается для отдельных клеток, а затем объединяется для клеток в культуре, в параллельных культурах и т. д.

Незапланированный синтез ДНК (UDS): синтез восстановления ДНК после вырезания и удаления участка ДНК, содержащего область повреждения, вызванного химическими веществами или физическими агентами.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДА ИСПЫТАНИЙ

UDS-тест с клетками печени млекопитающих in vivo указывает на синтез репарации ДНК после вырезания и удаления участка ДНК, содержащего область повреждения, вызванного химическими веществами или физическими агентами. Тест обычно основан на включении 3H-TdR в ДНК клеток печени, которые имеют низкую частоту появления клеток в S-фазе клеточного цикла. Поглощение 3H-TdR обычно определяют с помощью авторадиографии, поскольку этот метод не так чувствителен к помехам со стороны клеток S-фазы, как, например, жидкостный сцинтилляционный счетчик.

1.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1.4.1. Препараты

1.4.1.1. Выбор видов животных

Обычно используют крыс, хотя можно использовать любые подходящие виды млекопитающих. Следует использовать обычно используемые лабораторные штаммы молодых здоровых взрослых животных. В начале исследования вариация массы животных должна быть минимальной и не превышать ±20 % средней массы для каждого пола.

1.4.1.2. Условия содержания и кормления

Применяются общие условия, указанные в Общем введении к Части B, хотя целевая влажность должна составлять от 50 до 60 %.

1.4.1.3. Подготовка животных

Здоровые молодые взрослые животные случайным образом распределяются в контрольную и экспериментальную группы. Клетки должны быть расположены таким образом, чтобы возможные последствия их размещения были сведены к минимуму. Животные идентифицируются однозначно и содержатся в клетках не менее пяти дней до начала исследования, чтобы обеспечить акклиматизацию к лабораторным условиям.

1.4.1.4. Испытуемое вещество/препарат

Твердые тестируемые вещества следует растворить или суспендировать в соответствующих растворителях или носителях и при необходимости разбавить перед введением животным. Жидкие тестируемые вещества можно дозировать непосредственно или разбавлять перед дозированием. Следует использовать свежие препараты испытуемого вещества, если только данные о стабильности не подтверждают приемлемость хранения.

1.4.2. Условия испытаний

1.4.2.1. Растворитель/носитель

Растворитель/носитель не должен оказывать токсического воздействия при используемых дозах и не должен вызывать подозрений в химической реакции с испытуемым веществом. Если используются растворители/наполнители, отличные от хорошо известных, их включение должно быть подкреплено данными, указывающими на их совместимость. Рекомендуется, где это возможно, в первую очередь рассмотреть возможность использования водного растворителя/носителя.

1.4.2.2. Элементы управления

Параллельные положительные и отрицательные контроли (растворитель/носитель) должны быть включены в каждую независимо выполняемую часть эксперимента. За исключением обработки тестируемым веществом, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как с животными из обработанных групп.

Положительным контролем должны быть вещества, о которых известно, что они производят УДС при введении на уровнях воздействия, которые, как ожидается, будут давать заметное увеличение по сравнению с фоном. Положительные контроли, требующие метаболической активации, следует использовать в дозах, вызывающих умеренный ответ (4). Дозы могут быть выбраны так, чтобы эффекты были очевидны, но не раскрывали читателю сразу идентичность закодированных слайдов. Примеры веществ положительного контроля включают:

>ТАБЛИЦА>

Могут быть использованы другие соответствующие вещества положительного контроля. Допустимо, что положительный контроль следует вводить способом, отличным от пути введения тестируемого вещества.

1,5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Количество и пол животных

Следует использовать достаточное количество животных, чтобы принять во внимание естественные биологические вариации реакции на тест. Количество животных должно составлять не менее трех анализируемых животных на группу. Если накоплена значительная историческая база данных, для одновременных групп отрицательного и положительного контроля требуется только одно или два животных.

Если на момент исследования имеются данные исследований на одном и том же виде и с использованием одного и того же пути воздействия, которые демонстрируют отсутствие существенных различий в токсичности между полами, то тестирования на одном поле, предпочтительно на мужчинах, будет достаточно. . Если воздействие химических веществ на человека может зависеть от пола, как, например, в случае с некоторыми фармацевтическими агентами, испытания следует проводить на животных соответствующего пола.

1.5.2. График лечения

Тестируемые вещества обычно вводятся в виде однократного лечения.

1.5.3. Уровни доз

Обычно используют по меньшей мере два уровня дозы. Наивысшая доза определяется как доза, вызывающая признаки токсичности, при которой можно ожидать, что более высокие уровни дозы, основанные на том же режиме дозирования, приведут к летальному исходу. Как правило, более низкая доза должна составлять от 50% до 25% от высокой дозы.

Вещества со специфической биологической активностью в низких нетоксичных дозах (например, гормоны и митогены) могут быть исключениями из критериев установления дозы и должны оцениваться в каждом конкретном случае. Если исследование по определению диапазона проводится из-за отсутствия подходящих данных, его следует проводить в той же лаборатории с использованием того же вида, штамма, пола и схемы лечения, которые использовались в основном исследовании.

Высшую дозу можно также определить как дозу, которая вызывает некоторые признаки токсичности в печени (например, пикнотические ядра).

1.5.4. Предельный тест

Если тест с одной дозой по меньшей мере 2000 мг/кг массы тела, применяемой за один курс лечения или за два курса лечения в один и тот же день, не вызывает наблюдаемых токсических эффектов и если не ожидается генотоксичности, на основании данных структурно родственных веществ, то полное исследование может не потребоваться. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня дозы в предельном испытании.

1.5.5. Введение доз

Тестируемое вещество обычно вводят через зонд с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли. Другие пути воздействия могут быть приемлемыми, если они оправданы. Однако внутрибрюшинный путь не рекомендуется, так как он может подвергнуть воздействию тестируемого вещества непосредственно печень, а не через систему кровообращения. Максимальный объем жидкости, который можно вводить через зонд или путем инъекции за один раз, зависит от размера подопытного животного. Объем не должен превышать 2 мл/100 г массы тела. Использование объемов, превышающих эти, должно быть обосновано. За исключением раздражающих или разъедающих веществ, действие которых обычно усиливается при более высоких концентрациях, изменчивость объема испытания следует свести к минимуму путем регулирования концентрации, чтобы обеспечить постоянный объем при всех уровнях дозы.

1.5.6. Подготовка клеток печени

Клетки печени получают от обработанных животных обычно через 12-16 часов после введения дозы. Обычно требуется дополнительное более раннее время отбора проб (обычно через два-четыре часа после лечения), если только через 12-16 часов не будет четкого положительного ответа. Однако можно использовать альтернативное время отбора проб, если это оправдано токсикокинетическими данными.

Кратковременные культуры клеток печени млекопитающих обычно создаются путем перфузии печени in situ коллагеназой и предоставления возможности свежедиссоциированным клеткам печени прикрепиться к подходящей поверхности. Клетки печени животных отрицательного контроля должны иметь жизнеспособность (5) не менее 50 %.

1.5.7. Определение УДС

Свежевыделенные клетки печени млекопитающих обычно инкубируют со средой, содержащей 3H-TdR, в течение соответствующего периода времени, например от трех до восьми часов. В конце инкубационного периода среду следует удалить из клеток, которые затем можно инкубировать со средой, содержащей избыток немеченого тимидина, чтобы уменьшить неинкорпорированную радиоактивность («холодная погоня»). Затем клетки промывают, фиксируют и сушат. При более длительном инкубационном периоде холодная охота может не потребоваться. Предметные стекла погружают в авторадиографическую эмульсию, экспонируют в темноте (например, в холодильнике от 7 до 14 дней), проявляют, окрашивают и подсчитывают экспонированные зерна серебра. От каждого животного готовят два-три препарата.

1.5.8. Анализ

Препараты на предметных стеклах должны содержать достаточное количество клеток нормальной морфологии, чтобы можно было провести значимую оценку UDS. Препараты исследуют микроскопически на наличие признаков явной цитотоксичности (например, пикноза, снижения уровня радиоактивной метки).

Слайды должны быть закодированы до подсчета зерен. Обычно от каждого животного оценивают по 100 клеток как минимум с двух предметных стекол; оценка менее 100 клеток/животных должна быть оправдана. Подсчет зерен для ядер S-фазы не подсчитывается, но можно записать долю клеток S-фазы.

Количество включения 3H-TdR в ядра и цитоплазму морфологически нормальных клеток, о чем свидетельствует отложение зерен серебра, следует определять соответствующими методами.

2. ДАННЫЕ

2.1. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Должны быть предоставлены данные по отдельным предметным стеклам и животным. Кроме того, все данные должны быть сведены в табличную форму. Чистое количество ядерных зерен (NNG) следует рассчитывать для каждой клетки, для каждого животного, для каждой дозы и времени путем вычитания количества CG из количества NG. Если подсчитываются «восстанавливающиеся клетки», критерии определения «восстанавливающихся клеток» должны быть обоснованы и основаны на исторических или параллельных данных отрицательного контроля. Численные результаты могут быть оценены статистическими методами. Статистические тесты, если они используются, должны быть выбраны и обоснованы до проведения исследования.

2.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

>ТАБЛИЦА>

Следует учитывать биологическую значимость данных: т.е. следует принимать во внимание такие параметры, как различия между животными, взаимосвязь «доза-эффект» и цитотоксичность. Статистические методы могут использоваться в качестве вспомогательного средства при оценке результатов испытаний. Однако статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором положительного ответа.

Хотя большинство экспериментов дают явно положительные или отрицательные результаты, в редких случаях набор данных не позволяет сделать определенное суждение об активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться двусмысленными или сомнительными независимо от того, сколько раз повторяется эксперимент.

Положительный результат теста UDS с клетками печени млекопитающих in vivo указывает на то, что тестируемое вещество вызывает повреждение ДНК в клетках печени млекопитающих in vivo, которое можно исправить путем незапланированного синтеза ДНК in vitro. Отрицательный результат указывает на то, что в условиях испытания испытуемое вещество не вызывает повреждений ДНК, выявляемых этим тестом.

Следует обсудить вероятность того, что тестируемое вещество достигнет общего кровообращения или, в частности, целевой ткани (например, системная токсичность).

3. ОТЧЕТНОСТЬ

ОТЧЕТ ИСПЫТАНИЯ

Отчет об испытаниях должен включать следующую информацию.

Растворитель:

- обоснование выбора транспортного средства,

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/наполнителе, если они известны.

Тестовые животные:

- используемый вид/штамм,

- количество, возраст и пол животных,

- источник, жилищные условия, рацион и т.д.,

- индивидуальный вес животных в начале испытания, включая диапазон массы тела, среднее значение и стандартное отклонение для каждой группы.

Условия испытаний:

- положительный и отрицательный контроль транспортных средств/растворителей,

- данные исследования по определению диапазона, если оно проводилось,

- обоснование выбора уровня дозы,

- подробности приготовления тестируемого вещества,

- подробности введения испытуемого вещества,

- обоснование пути введения,

- методы проверки того, что тестируемый агент достиг общего кровообращения или целевой ткани, если применимо,

- преобразование концентрации исследуемого вещества в рационе/питьевой воде (ppm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела/день), если применимо,

- сведения о качестве продуктов питания и воды,

- подробное описание графиков обработки и отбора проб,

- методы измерения токсичности,

- способ получения и культивирования клеток печени,

- использованный авторадиографический метод,

- количество подготовленных слайдов и количество оцененных клеток,

- критерии оценки,

- критерии признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными.

Полученные результаты:

- средние значения отдельных слайдов, животных и групп для ядерных зерен, цитоплазматических зерен и чистых ядерных зерен,

- зависимость «доза-реакция», если таковая имеется,

- статистическая оценка, если таковая имеется,

- признаки токсичности,

- одновременные отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные,

- исторические отрицательные (растворитель/носитель) и положительные контрольные данные с диапазоном, средними значениями и стандартными отклонениями,

- количество «восстанавливающихся клеток», если определено,

- количество клеток S-фазы, если определено,

- жизнеспособность клеток.

Обсуждение результатов

Выводы

4. ССЫЛКИ

(1) Эшби, Дж. Лефевр, П.А., Берлинсон, Б. и Пенман, М.Г. (1985), Оценка крысы in vivo. Анализ восстановления ДНК гепатоцитов, Mutation Res., 156, стр. 1-18.

(2) Баттерворт, Б. Э., Эшби, Дж., Бермудес, Э., Кашиано, Д., Мирсалис, Дж., Пробст, Г. и Уильямс, Г. (1987), Протокол и руководство для гепатоцитов крысы in vivo. Анализ восстановления ДНК, Mutation Res., 189, стр. 123-133.

(3) Кеннелли, Дж. К., Уотерс, Р., Эшби, Дж., Лефевр, П. А., Берлинсон, Б., Бенфорд, Д. Дж., Дин, С. В. и Митчелл, И. де Г. (1993), UDS печени крысы in vivo Анализ, в: Киркланд Д.Дж. и Фокс М. (ред.), Дополнительные тесты на мутагенность: Рекомендуемые процедуры UKEM. Подкомитет UKEMS по рекомендациям по испытаниям на мутагенность. Отчет. Пересмотренная часть II, издательство Кембриджского университета, Кембридж, Нью-Йорк, Порт-Честер, Мельбурн, Сидней, стр. 52–77.

(4) Мэдл С., Дин С.В., Андрак У., Брамбилла. Г., Берлинсон Б., Дулиттл Д.Дж., Фурихата К., Хертнер Т., МакКуин К.А. и Мори Х. (1993), Рекомендации по проведению тестов UDS in vitro и in vivo, Mutation Res. , 312, стр. 263-285.

(5) Фаутц Р., Хусейн Б., Эфстатиу Э. и Хехенбергер-Фрейдл. C. (1993), Оценка связи между начальной жизнеспособностью и прикреплением свежевыделенных гепатоцитов крысы, используемых для анализа восстановления ДНК in vivo/in vitro (UDS), Mutation Res., 291, стр. 21-27.

(6) Мирсалис Дж. К., Тайсон С. К. и Баттерворт Б. Е. (1982), Обнаружение генотоксичных канцерогенов в анализе восстановления ДНК гепалоцитов in vivo/in vitro, Environ. Мутаген, 4, стр. 553-562».

ПРИЛОЖЕНИЕ 5

СВ:

3.2.3. Опасный

R65 Опасно: при проглатывании может вызвать повреждение легких.

Жидкие вещества и препараты, которые из-за малой вязкости представляют опасность для человека при аспирации.

а) для веществ и препаратов, содержащих алифатические, алициклические и ароматические углеводороды в суммарной концентрации 10% и более и

- имеет время истечения менее 30 секунд, измеренное с помощью выпускного стакана диаметром 3 мм в соответствии с ISO 2431, или

- имеет кинематическую вязкость менее 7 × 10-6 м2/с при 40 °C, измеренную калиброванным стеклянным капиллярным вискозиметром в соответствии с ISO 3104 и ISO 3105, или

- имеет кинематическую вязкость менее 7 × 10-6 м2/с при 40 °С, определенную методом ротационной вискозиметрии в соответствии с ISO 3219.

Однако вещества и препараты, отвечающие этим критериям, не нуждаются в классификации, если они имеют среднее поверхностное натяжение выше 33 мН/м при 25 °C, измеренное с помощью Дю Нуитензиометра или в соответствии с методами испытаний, описанными в Приложении V, часть А. 5.

б) Для веществ и препаратов, основанных на практическом опыте человека.

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

ФИ:

3.2.6.1 Воспаление кожи

Следующая характеристика опасности определяется в соответствии с критериями, представленными ниже:

R38 Раздражает кожу.

- Вещества и препараты вызывают значительное воспаление кожи после воздействия максимум в течение четырех часов, что определяется тестом на раздражение кожи кролика, упомянутым в Приложении V. Воспаление длится не менее 24 часов.

Воспаление кожи является значительным, если:

а) среднее числовых значений, характеризующих интенсивность покраснения и образования или отека струпьев, рассчитанное для всех подопытных животных, составляет не менее 2;

б) или если испытание, указанное в Приложении V, было завершено с использованием трех подопытных животных, среднее числовых значений, описывающих интенсивность покраснения кожи и образования корок или отека, по крайней мере, у двух подопытных животных, рассчитанное отдельно для каждого подопытного животного. , составляет не менее 2.

В обоих случаях для расчета средних значений необходимо использовать все числовые значения, полученные при оценке эффекта каждые 24 часа, 48 часов и 72 часа.

Воспаление также считается значимым, если воспаление кожи продолжается как минимум у двух подопытных животных до конца периода наблюдения. Необходимо учитывать особые эффекты, такие как гиперплазия, шелушение, изменение цвета, трещины, струпья и выпадение волос.

Соответствующую информацию можно также получить в ходе испытаний на животных при неостром воздействии (см. примечания к R48 в разделе 2.d). Эффекты считаются значимыми, если они соответствуют эффектам, описанным выше.

- Вещества и препараты, вызывающие у человека значительное воспаление кожи при немедленном, продолжительном или неоднократном контакте.

- Органические пероксиды, если нет доказательств отсутствия такого эффекта.

Тунтохарха («парестезия»):

Парестезия у людей, вызванная контактом кожи с пиретроидным пестицидом, не считается раздражающим действием, которое оправдывало бы классификацию Xi; Р38. Однако S-фраза S24 должна применяться к веществам с таким эффектом.

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии SV)

В пункте 6.2 (Фразы безопасности для веществ и препаратов):

ИЗ:

S 28 При попадании на кожу немедленно смыть большим количеством... (указывается производителем)

- Область применения:

- очень токсичные, ядовитые или едкие вещества и препараты;

- Использовать:

- обязательно для очень токсичных веществ и препаратов;

- рекомендуется для других веществ и препаратов, упомянутых выше, особенно если вода не является подходящей промывочной жидкостью;

- рекомендуется для агрессивных веществ и препаратов, распространяемых среди населения.

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии FI)

(Не касается версии SV)

ФИ:

S 29 Не сливать в канализацию

- Объем:

- легковоспламеняющиеся или легковоспламеняющиеся жидкости, несмешивающиеся с водой,

- высокотоксичные или ядовитые вещества и препараты,

- экологически опасные вещества.

- Основы использования:

- обязательно для веществ, которые могут использоваться в общем потреблении, которые опасны для окружающей среды и классифицируются кодом N, если только это не предназначено для использования вещества,

- рекомендуется для других веществ или препаратов, упомянутых выше, которые могут использоваться для общего потребления, за исключением случаев, когда данное химическое вещество используется по назначению.

(Не касается версии ES)

(Не касается версии DA)

(Не касается версии DE)

(Не касается версии EL)

(Не касается версии EN)

(Не относится к версии FR)

(Не касается IT-версии)

(Не касается версии NL)

(Не касается версии PT)

(Не касается версии SV)

ПРИЛОЖЕНИЕ 6

"ПРИЛОЖЕНИЕ IX

ЧАСТЬ А

Положения, касающиеся креплений с защитой от детей

В дополнение к положениям статьи 22(1)(e) настоящей Директивы, контейнеры любой вместимости, содержащие вещества, представляющие опасность при аспирации (Xn; R65), классифицированные и маркированные в соответствии с параграфом 3.2.3 Приложения VI к настоящей Директиве, за исключением веществ, поступающих на рынок в виде аэрозолей или в контейнере, снабженном герметичной распылительной насадкой, должны быть оснащены креплениями, защищенными от детей.

1. Многоразовая упаковка

Застежки с защитой от детей, используемые на многоразовых упаковках, должны соответствовать стандарту ISO 8317 (издание от 1 июля 1989 г.) «Упаковки с защитой от детей. Требования и методы испытаний многоразовых упаковок», принятому Международной организацией по стандартизации (ISO).

2. Неповторно закрывающиеся упаковки

Крепления с защитой от детей, используемые на упаковках с возможностью повторного закрытия, должны соответствовать стандарту CEN EN 862 (издание от марта 1997 г.), касающемуся «Упаковка. Упаковка с защитой от детей. Требования и процедуры испытаний для упаковок с возможностью повторного закрытия для нефармацевтической продукции», принятого Европейским комитетом по стандартизации (CEN). Европейский комитет по стандартизации (CEN).

3. Примечания

1. Доказательства соответствия вышеуказанным стандартам могут быть сертифицированы только лабораториями, которые соответствуют серии европейских стандартов EN 45 000.

2. Конкретные случаи

Если кажется очевидным, что упаковка достаточно безопасна для детей, поскольку они не могут получить доступ к содержимому без помощи инструмента, тест проводить не нужно.

Во всех других случаях и при наличии достаточных оснований сомневаться в безопасности укупоривания для ребенка национальный орган может попросить лицо, ответственное за выпуск продукта на рынок, выдать ему сертификат лаборатории, описанной в 3.1, с указанием что либо:

- тип затвора таков, что нет необходимости проводить испытания на соответствие стандартам ISO и CEN, упомянутым выше,

или

- затвор был протестирован и признан соответствующим стандартам, указанным выше.

ЧАСТЬ Б

Положения, касающиеся тактильных сигнальных устройств

Технические характеристики тактильных сигнальных устройств должны соответствовать стандарту EN ISO 11683 (издание 1997 г.) «Упаковка – Тактильные предупреждения об опасности – Требования».